高效液相色譜-串聯質譜法測定蝦中萬古霉素及去甲萬古霉素殘留量

薛婷婷，黃冬梅，嚴敏鳴，韓 峰,王 政，史永富,田良良

(1.中國水產科學研究院 東海水產研究所，上海 200090；2.上海海洋大學 食品科學與工程，上海 201306； 2.上海市浦東新區農產品檢測中心，上海 201202)

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高效液相色譜-串聯質譜法測定蝦中萬古霉素及去甲萬古霉素殘留量

薛婷婷1,2，黃冬梅1*，嚴敏鳴3，韓 峰1,王 政3，史永富1,田良良1

(1.中國水產科學研究院 東海水產研究所，上海 200090；2.上海海洋大學 食品科學與工程，上海 201306； 2.上海市浦東新區農產品檢測中心，上海 201202)

建立了蝦中萬古霉素和去甲萬古霉素殘留量的高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)檢測方法。樣品經0.1%甲酸-乙腈(9∶1，體積比)混合溶液提取，乙腈飽和的正己烷除脂，PCX結合Florisil固相萃取柱進行凈化后，以乙腈和0.1%甲酸溶液為流動相，經CAPCELL PAK MG-C18色譜柱分離后，采用高效液相色譜-串聯質譜在多反應離子監測(MRM)模式進行測定，以雙去氯萬古霉素作為內標物，內標法定量。結果表明：萬古霉素和去甲萬古霉素在2～250 ng/mL范圍內呈良好的線性關系，相關系數(r2)均大于0.99。在5，25，50 μg/kg加標水平下，萬古霉素和去甲萬古霉素的平均回收率為87.2%～102%，相對標準偏差為1.3%～8.7%。方法的檢出限(LOD)為2.0 μg/kg，定量下限(LOQ)為5.0 μg/kg。該方法靈敏、準確，重復性好，適用于蝦類中萬古霉素及去甲萬古霉素殘留量的測定。

萬古霉素；去甲萬古霉素；雙去氯萬古霉素；蝦；高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)

萬古霉素和去甲萬古霉素是由東方鏈霉菌代謝產生的糖肽類抗生素[1]。這種藥物通過抑制細胞壁中磷脂和多肽的生成,進而干擾細胞壁的合成[2],對革蘭陽性球菌與桿菌具有強大抗菌作用[3]。此外，萬古霉素因其特殊的分子結構，可有效治療一些耐藥菌株，如超級病菌NDM-1等[4]。因此萬古霉素和去甲萬古霉素作為抗生素被不法經營者用于養殖業的情況日漸增多[5]。該類藥物可通過食物鏈進入人體，導致人類聽力減退甚至缺失，腎小管受損，甚至造成腎衰竭[6]。一些國家制定了相關食品中的殘留限量標準[7]，日本規定牛奶中萬古霉素的限量值為10 μg/kg[8]。而我國農業部第560號公告中規定萬古霉素為禁用獸藥[9]，未提出萬古霉素在食品中的最大殘留限量MRL值。衛生部將萬古霉素列入《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑名單(第1-5批匯總)》，并注明需研制針對動物性食品中該藥物的檢測方法[10]。目前雖有豬肉[5]和乳制品[6]中萬古霉素殘留量的相關檢測文獻，但水產品領域中的相關研究尚屬空白。我國是蝦類主要養殖大國，蝦產品出口貿易呈逐年增長趨勢，因此，建立一種適用于蝦類中萬古霉素和去甲萬古霉素殘留量的檢測方法具有重要的意義。

國內外已有報道的萬古霉素等糖肽抗生素含量的主要檢測方法有免疫法[11-16]、高效液相色譜法(HPLC)[17-20]、液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)[21-24]。對于基質復雜的樣品，免疫法因專屬性較差，所以較少采用。相對HPLC法，HPLC-MS/MS具有靈敏度高、定性更準確的優勢。而選用內標法定量，可有效降低實際操作中條件波動對分析結果的影響。本文選擇雙去氯萬古霉素作為內標物，利用高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜儀測定蝦類中萬古霉素及去甲萬古霉素，該方法具有較好的檢測準確性和靈敏度，可滿足殘留檢測的要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000高效液相色譜-串聯TSQ ENDURA三重四極桿質譜(美國Thermo Fisher公司)；Genius 3旋渦混合器(德國IKA公司)；5510超聲波清洗儀(美國Branson公司)；Multifuge X 3R高速離心機(Thermo公司)；BCD-215DC冰箱(中國Haier公司)；N-EVAPTM111型氮吹儀(美國Organomation Aossociates公司)；VisiprepTMDL固相萃取裝置(美國Supelco公司)；PCX固相萃取柱(200 mg/6 mL，Aglient公司)；Florisil固相萃取柱(500 mg/6 mL，Agela公司)。

萬古霉素(純度94.1%，Dr.Ehrenstorfer GmbH)；去甲萬古霉素(純度83.4%，中國藥品生物制品檢定所)；雙去氯萬古霉素(純度75%，Toronto Research Chemicals)；甲醇、乙腈(HPLC級，J,T.Baker)；甲酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；正己烷(HPLC級，J.T.Baker);0.1%甲酸溶液-乙腈混合溶液(7∶3，體積比)；5%氨化甲醇。

1.2 標準溶液的配制

混合標準儲備液：分別準確稱取萬古霉素、去甲萬古霉素和雙去氯萬古霉素，用0.1%甲酸溶解，配制成100 μg/mL的標準混合儲備液和內標液；再分別用0.1%甲酸稀釋成1 μg/mL混合標準溶液和內標液。根據需要，用0.1%甲酸溶液逐級稀釋成2，5，10，25，50，100,250 ng/mL的標準工作液，其中內標液濃度為50 ng/mL，現用現配。以上標準溶液于4 ℃冰箱避光冷藏。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提 取 準確稱取蝦樣品2 g(精確至0.01 g)于50 mL聚丙烯離心管中，加入100 μL 1 μg/mL的雙去氯萬古霉素內標液，用9 mL 0.1%的甲酸-乙腈混合溶液提取，渦旋混合1 min，超聲10 min，8 000 r/min離心6 min，取上清液至另一50 mL離心管中。殘渣重復提取1次，合并上清液,用提取液定容至20 mL，取10 mL待凈化。

1.3.2 凈 化 在上述溶液中加入5 mL乙腈飽和的正己烷，充分振蕩混勻，4 000 r/min離心10 min，去除上層正己烷層，重復去脂1次，下層溶液備用過柱。PCX固相萃取柱依次用5 mL乙腈和5 mL 0.1%甲酸溶液活化，Florisil固相萃取柱依次用5 mL甲醇和5 mL 5%氨化甲醇活化。取溶液以每秒1滴的速度過PCX柱，10 mL蒸餾水淋洗，抽干柱子，5 mL 5%氨化甲醇洗脫，收集洗脫液過Florisil柱，收集過柱液，3 mL 5%氨化甲醇淋洗，收集全部淋洗液，于45 ℃氮氣吹至近干。以1 mL 0.1%甲酸復溶，混勻，過0.22 μm濾膜后，供 LC-MS/MS分析。

1.4 色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK MG-C18(100 mm×2.0 mm,5 μm)；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：25 μL；流動相：A為0.1%甲酸，B為乙腈。洗脫梯度：0～0.5 min，95% A；0.5～2.5 min，95%～75% A；2.5～5.0 min，75% A；5.0～6.1 min,75%～95% A；6.1～8.1 min，95% A。

表1 萬古霉素、去甲萬古霉素及雙去氯萬古霉素的質譜參數

*quantitative ion

1.5 質譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；檢測方式：多反應離子監測(MRM)；掃描方式：正離子模式；噴霧電壓：3 000 V；鞘氣流量：35 mL/min；輔助氣流量：10 mL/min；離子傳輸毛細管溫度：350 ℃。其他質譜參數見表1。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

萬古霉素、去甲萬古霉素和雙去氯萬古霉素均為多肽類抗生素，在一級質譜中，易與H+結合，產生帶正電的雙電荷離子[M+H]2+，經過二級碰撞后，產生不同強度的碎片離子，以豐度最大的m/z144.0，144.0，100.1分別作為3種化合物的定量離子。確定特征碎片離子后，對碰撞能量等其他質譜參數進行優化，優化后的質譜參數見“1.5”及表1。

2.2 色譜條件的選擇

因甲酸可為化合物提供必需的質子來源，提高其離子化效率[5]，故在萬古霉素和去甲萬古霉素殘留分析中使用的流動相多為0.1%甲酸-乙腈體系。經查閱，萬古霉素在C18柱上有較好的保留效果[1]，本文比較了AgilentEC-C18(2.1 mm×100 mm，2.7 μm)，AgilentGlycan-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)和Capcell PAK MG-C18(2.0 mm×100 mm，5 μm) 3種不同C18色譜柱的效果，結果顯示Capcell PAK MG-C18色譜柱對萬古霉素和去甲萬古霉素的保留效果最好。在此條件下萬古霉素、去甲萬古霉素及雙去氯萬古霉素的響應值高，且峰形尖銳、對稱。

圖1 4種不同提取溶液對萬古霉素和去甲萬古霉素的提取效果比較Fig.1 Comparison recoveries of vancomycin and norvancomycin by four different kinds of extract solutions

2.3 前處理條件的優化

2.3.1 提取試劑的選擇 根據萬古霉素和去甲萬古霉素易溶于水，微溶于乙腈的性質，本文比較了0.1%甲酸、10%三氯乙酸、6%高氯酸以及純乙腈4種試劑作為提取溶液時對加標回收率的影響，結果見圖1。純乙腈的提取回收率最低，三氯乙酸和高氯酸的提取回收率僅為40%～60%，而0.1%甲酸的提取回收率最高，但會有水溶性蛋白溶出，造成雜質較多，提取液較為渾濁，不利于下步凈化。因此本文在0.1%甲酸中加入一定比例的乙腈，采用0.1%甲酸-乙腈(7∶3，體積比)提取，該條件下提取回收率高，同時能沉淀部分蛋白和雜質，利于下步凈化。

圖2 羅氏沼蝦加標樣品圖(25 μg/kg)Fig.2 Spiked samples of Giant freshwater prawn(25 μg/kg)

2.3.2 凈化及固相萃取小柱的優化 首先采用正己烷(乙腈飽和)去除提取液中的部分脂類雜質，而后采用固相萃取小柱進一步凈化處理。萬古霉素等目標物分子結構中含有1個堿性的伯氨基團，帶有弱堿性，而蝦類樣品中富含色素等雜質，因此本實驗采用以水浸潤型聚合物為基質的陽離子交換柱PCX柱和硅膠鍵合氧化鎂吸附劑的Florisil固相萃取柱聯合去雜，結果表明此方法能夠有效去除雜質，具有良好的凈化效果，且兩種化合物的回收率均在80%～110%之間，能滿足檢測要求。 陰性羅氏沼蝦樣品中添加25 μg/kg目標物的加標譜圖見圖2。

2.4 內標物的選擇

目前已報道[25]用于萬古霉素和去甲萬古霉素殘留的內標物有甲硝唑和維生素B12，但其在實際樣品前處理過程中損失較大，不能滿足本實驗作為內標物的要求。作者通過萬古霉素相關性質資料查詢[26]，發現雙去氯萬古霉素的結構和基本性質與萬古霉素相似，滿足內標物的要求。因此，本文采用雙去氯萬古霉素作為內標物，使用該內標物進行復雜基質樣品中萬古霉素和去甲萬古霉素檢測的研究尚未見報道。

2.5 線性范圍、檢出限與定量下限

將濃度分別為2，5，10，25，50，100，250 ng/mL的待測物系列混合標準工作液上機測定，以目標物和內標物的峰面積比值(y)為縱坐標，標準溶液濃度(x,ng/mL)為橫坐標，繪制標準曲線。結果顯示，萬古霉素和去甲萬古霉素在2～250 ng/mL范圍內線性關系良好，相關系數(r2)均大于0.99，其線性范圍、線性方程、相關系數見表2。在蝦空白樣品中添加2種目標化合物，按樣品前處理步驟和儀器條件進行檢測，根據信號響應值，以3倍信噪比確定方法檢出限(LOD，S/N≥3)，10倍信噪比確定定量下限(LOQ，S/N≥10)，測得萬古霉素和去甲萬古霉素的檢出限均為2.0 μg/kg，定量下限均為5.0 μg/kg。本方法具有較高的靈敏度。

表2 萬古霉素和去甲萬古霉素的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限及定量下限

2.6 回收率與相對標準偏差

選擇不含待測目標物的羅氏沼蝦空白基質樣品進行加標回收實驗，分別添加5，25，50 μg/kg 3個濃度水平的標準溶液，每個加標濃度做6個平行樣，分別計算萬古霉素和去甲萬古霉素的回收率，測得萬古霉素的平均添加回收率為91.8%～102%，去甲萬古霉素為87.2%～98.4%，相對標準偏差(RSD)為1.3%～8.7%(見表3)。綦艷等[24]采用LC-MS/MS 檢測乳制品中的萬古霉素殘留量，在15,60，150 μg/kg加標水平下的回收率約80%。數據表明，本文建立的方法準確度較高，具有較好的精密度。

表3 羅氏沼蝦空白樣品中添加2種目標物的平均回收率及相對標準偏差

2.7 實際樣品的檢測

從上海農貿市場購買南美白對蝦、基圍蝦、青蝦、河蝦等多種蝦類樣品，在優化條件下進行檢測，同時做質控樣品。結果在上述樣品中均未檢出萬古霉素和去甲萬古霉素，質控樣品中兩種化合物的回收率為81.4%～106%，精密度小于10%，達到殘留分析要求，數據準確可靠。同時由3家經過認證的實驗室對本方法做驗證實驗，結果表明本方法滿足殘留檢測的各項指標。

3 結 論

本文建立了高效液相色譜-串聯質譜檢測蝦類樣品中萬古霉素和去甲萬古霉素殘留的分析方法，該方法首次使用雙去氯萬古霉素作為內標物進行定量分析。優化了樣品前處理、色譜及質譜條件，有效提高了檢測的靈敏度和準確度。該方法回收率高，定量下限和精密度滿足殘留檢測的要求，適用于蝦類中萬古霉素及去甲萬古霉素殘留量的同時檢測。

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Determination of Vancomycin and Norvancomycin Residues in Shrimps by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

XUE Ting-ting1,2,HUANG Dong-mei1*,YAN Min-ming3,HAN Feng1,WANG Zheng3,SHI Yong-fu1,TIAN Liang-liang1

(1.East China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Shanghai 200090,China;2.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;3.Testing Center of Agricultural Products,Pudong New Area,Shanghai 201202,China)

A new method for the determination of vancomycin and norvancomycin residues in shrimps by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS) was established.Samples were extracted with 0.1% formic acid-acetonitrile solution,defatted withn-hexane saturated with acetonitrile and purified with PCX and Florisil solid phase extraction column.The separation of two targets was carried out on a CAPCELL PAK MG-C18column by gradient elution with 0.1% formic acid-acetonitrile as mobile phase．The identification of two analytes was performed in multi-reaction monitoring(MRM),and the quantification was carried out by the internal standard method.Dedichloro vancomycin was used as an internal standard.The calibration curves showed good linearities in the range of 2-250 ng/mL with correlation coefficients(r2) greater than 0.99.The detection limits(LOD) of this method were both 2.0 μg/kg,and the limits of quantitation(LOQ) were 5.0 μg/kg.The recoveries of the target compounds at spiked levels of 5,25,50 μg/kg were in the range of 87.2%-102%,with relative standard deviations(RSDs) of 1.3%-8.7%.The results indicated that this method had high sensitivity,accuracy and good reproducibility.It was suitable for the simultaneous determination of ancomycin and norvancomycin residues in shrimps.

vancomycin;norvancomycin;dedichloro vancomycin;shrimps;high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)

2017-01-17；

2017-03-06

農業行業標準制定和修定農產品質量安全項目(2130109)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.06.012

O657.63;O629.5

A

1004-4957(2017)06-0773-05

*通訊作者：黃冬梅，研究員，研究方向：食品質量安全，Tel：021-65680121，E-mail:hdm2001@126.com