NOX通路在氧化應激誘導的宮頸癌細胞凋亡中的作用

王井，汪洪濤，馬華，孫美群，趙衛(wèi)東

(1安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院，合肥 230001;2 蚌埠醫(yī)學院)

NOX通路在氧化應激誘導的宮頸癌細胞凋亡中的作用

王井1，汪洪濤2，馬華2，孫美群2，趙衛(wèi)東1

(1安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院，合肥 230001;2 蚌埠醫(yī)學院)

目的 探討煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)通路在氧化應激誘導的宮頸癌細胞凋亡中的作用。方法 流式細胞術檢測不同類型宮頸癌細胞內(nèi)在的總活性氧(ROS)水平及NOX途徑抑制劑DPI處理前后不同類型宮頸癌細胞內(nèi)線粒體途徑和NOX途徑ROS水平；DPI預處理、H2O2作用后采用流式細胞術檢測不同類型宮頸癌細胞凋亡率。結果 人乳頭瘤病毒(HPV)陽性宮頸癌細胞內(nèi)在ROS水平明顯高于HPV陰性宮頸癌細胞(P<0.05)，兩類宮頸癌細胞線粒體途徑來源ROS水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與預處理前比較，DPI預處理后HPV陽性宮頸癌細胞內(nèi)在ROS水平均明顯降低(P均<0.05)。與誘導前及HPV陰性宮頸癌細胞比較，H2O2誘導后HPV陽性宮頸癌細胞凋亡率均明顯升高，且高于DPI預處理及DPI預處理+H2O2誘導細胞(P均<0.05)。結論 NOX通路在HPV感染導致宮頸癌的過程中具有重要作用，促氧化治療可能更好地殺傷HPV陽性宮頸癌細胞。

宮頸癌；人乳頭瘤病毒；氧化應激；活性氧；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶

宮頸癌在全球婦女癌癥病死率中位居第二，僅次于乳腺癌，在一些發(fā)展中國家甚至居于首位，并具有年輕化趨勢；全球每年大約有50萬婦女發(fā)病，我國每年有13～15萬新發(fā)宮頸癌病例，占全球新發(fā)病例的1/3，嚴重威脅著廣大婦女的健康和生命[1]。人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌的主要致病因子，宮頸上皮組織暴露與氧化應激，促進了病毒的持續(xù)和慢性感染。在宿主細胞中病毒基因組的整合產(chǎn)生遺傳重排，基因組不穩(wěn)定，導致致瘤轉化的風險增加[2,3]。研究表明，HPV陽性宮頸癌細胞比HPV陰性宮頸癌細胞對化療和放療有更好的反應性[4,5]，化療和放療主要通過產(chǎn)生高濃度活性氧(ROS)引起細胞凋亡。因此，闡明ROS的分子信號機制，有助于我們理解HPV致病機制及優(yōu)化治療HPV相關腫瘤的策略。2015年8月～2016年8月我們進行了如下研究，旨在探討不同類型宮頸癌細胞的氧化應激狀態(tài)，以及NOX通路在氧化應激誘導的宮頸癌細胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞系：HPV-16陽性細胞株(SiHa、CaSki)，HPV-18陽性細胞株(HeLa、C4-I)，HPV陰性細胞株(C33A細胞)；其中SiHa、CaSki、HeLa、C33A細胞株均購自中國科學院北京協(xié)和細胞庫，C4-I由西安交通大學第一附屬醫(yī)院科研中心提供。主要試劑及儀器：DMEM，MEM培養(yǎng)基，F(xiàn)BS(Gibco)；DCHF-DA分子探針(Sigma)，線粒體特異性超氧化物分子探針MitSox(Invitrogen)，diphenyleneiodonium chloride (DPI, Sigma)；Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit (碧云天)，F(xiàn)ACSCalibur 流式細胞儀(BD)。

1.2 細胞培養(yǎng) C33A細胞使用含10% FBS的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，其他宮頸癌細胞均使用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每1 mL培養(yǎng)液中含青、鏈霉素各100 U，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天或隔天進行換液，2～3天傳代一次，每次實驗使用對數(shù)生長期的細胞。

1.3 宮頸癌細胞基礎ROS水平檢測 取對數(shù)生長期的宮頸癌細胞，胰酶消化處理，完全培養(yǎng)液重懸細胞制備成2×105個/mL的細胞懸液，接種于6孔板，2 mL/孔，置37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后棄去培養(yǎng)基，更換用無血清培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA(終濃度為10 μmol/L)，200 μL/孔，37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min。用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3次(以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA)。消化，收集細胞，流式細胞術檢測。ROS水平以平均熒光強度(MFI)表示。

1.4 DPI處理前后不同宮頸癌細胞內(nèi)總ROS及線粒體途徑ROS水平檢測 取對數(shù)生長期的宮頸癌細胞，胰酶消化處理，完全培養(yǎng)液重懸細胞制備成2×105個/mL的細胞懸液，接種于6孔板，2 mL/孔，置37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后棄去培養(yǎng)基，加入用無血清培養(yǎng)基稀釋的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)途徑特異性抑制劑DPI(終濃度1 μmol/L)，作用60 min。負載探針MitoSox (終濃度5 μmol/L)，37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min。消化，收集細胞，流式細胞術檢測。ROS水平以MFI表示。

1.5 H2O2誘導前后不同宮頸癌細胞內(nèi)ROS水平及細胞凋亡率檢測 取對數(shù)生長期的宮頸癌細胞，胰酶消化處理，完全培養(yǎng)液重懸細胞制備成2×105個/mL的細胞懸液，接種于6孔板，2 mL/孔，置37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞鋪滿70%～80%瓶底，DPI預處理1 h(終濃度1 μmol/L)或不處理，更換含100 μmol/L H2O2的完全培養(yǎng)基作用6 h(H2O2濃度和作用時間通過預實驗確定)，消化，收集細胞，Annexin V-FITC/PI雙染，流式細胞術檢測各組細胞凋亡率。ROS水平檢測方法同1.3。

2 結果

2.1 不同類型宮頸癌細胞內(nèi)ROS水平比較 HPV陽性宮頸癌細胞內(nèi)基礎ROS水平為46 000±285(SiHa、CaSki、HeLa、C4-1分別為46 145±288、45 832±279、44 731±266、45 175±274)，HPV陰性宮頸癌細胞C33A為4 200±62，二者比較P<0.05。

2.2 DPI處理前后不同宮頸癌細胞內(nèi)總ROS及線粒體途徑ROS水平比較 不同類型宮頸癌細胞線粒體水平來源ROS水平比較無明顯差異(P>0.05)。DPI處理后HPV陽性宮頸癌細胞株細胞內(nèi)ROS水平明顯降低(P<0.05)，而線粒體途徑超氧化物水平比較無明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 DPI處理前后不同宮頸癌細胞內(nèi)總ROS及線粒體途徑ROS水平比較

注：與DPI處理前比較，*P<0.05。

2.3 H2O2誘導前后不同宮頸癌細胞內(nèi)ROS水平變化及細胞凋亡 H2O2誘導不同宮頸癌細胞后，細胞內(nèi)總ROS水平均明顯升高(P均<0.05)，并促進細胞凋亡(P均<0.05)；與HPV陰性宮頸癌細胞相比，HPV陽性宮頸癌細胞凋亡率明顯增加(P<0.01)；NOX途徑抑制劑DPI預處理后，能明顯降低H2O2誘導的HPV陽性宮頸癌細胞凋亡(P<0.05)。見表2、3。

表2 H2O2誘導前后不同宮頸癌細胞內(nèi)ROS水平比較

注：與H2O2誘導前比較，*P<0.05。

表3 H2O2誘導及NOX途徑抑制劑DPI預處理后宮頸癌細胞凋亡情況

注：與H2O2誘導前比較，*P<0.05，△P<0.01；與C33A細胞同時間點比較，#P<0.01；與H2O2誘導后比較，▲P<0.05。

3 討論

在活細胞中，內(nèi)源性ROS是新陳代謝的副產(chǎn)物，大部分內(nèi)源性的活性氧產(chǎn)生于線粒體電子傳遞鏈[5～8]。ROS也可以來源于內(nèi)外源性刺激，如UV輻射，射線輻射及化學藥物等刺激，通過NOX途徑產(chǎn)生[9]。在所有需氧細胞，ROS和抗氧化物質(zhì)處于一種生理平衡狀態(tài)，一旦這種平衡被打破，發(fā)生氧化應激，ROS產(chǎn)生增加。ROS產(chǎn)生氧化應激會通過脂質(zhì)過氧化，DNA損傷和蛋白質(zhì)破壞，促進正常細胞轉化為腫瘤細胞[10,12]。ROS也可促進腫瘤細胞增殖和遷移[13～15]，因此長期以來ROS被認為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和復發(fā)的重要因素。然而，近年來對ROS的研究發(fā)現(xiàn)，機體可以利用ROS控制癌細胞的生長，抑制腫瘤細胞的遷移[16～18]，所以細胞的氧化還原狀態(tài)很可能成為潛在的治療靶標。

高危型HPV感染與宮頸癌關系密切，其中HPV16和HPV18是最常見的兩種類型[6]。很多研究表明，HPV陽性宮頸癌細胞比HPV陰性宮頸癌細胞對化療和放療有更好的反應性[4,5]。為了探討氧化應激與HPV是否存在一定的關聯(lián)，我們分別選取了HPV16陽性、HPV18陽性及HPV陰性宮頸癌細胞作為研究對象，利用DCHF-DA分子探針檢測這些癌細胞內(nèi)ROS水平。本研究結果表明，HPV陽性宮頸癌細胞的胞內(nèi)ROS水平明顯高于HPV陰性宮頸癌細胞，與Marullo等[19]在HPV相關頭頸癌細胞的研究結果類似。Marullo等[19]研究結果顯示HPV相關頭頸癌細胞內(nèi)ROS的升高與致瘤蛋白HPV E6/E7的作用有關。HPV陽性宮頸癌細胞內(nèi)高水平的ROS暗示其胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)存在缺陷，放化療治療通?？梢鹧趸瘧ぎa(chǎn)生大量ROS，導致細胞毒害作用，引起腫瘤細胞死亡。HPV陽性宮頸癌細胞對放化療比HPV陰性細胞敏感可能與宮頸癌細胞的氧化應激狀態(tài)有關。ROS有兩種主要途徑：線粒體途徑和NOX途徑。我們研究發(fā)現(xiàn)，NOX途徑是HPV陽性宮頸癌細胞ROS產(chǎn)生的主要來源，NADPH氧化酶最早發(fā)現(xiàn)于中性粒細胞和巨噬細胞內(nèi)，因此又稱呼吸爆發(fā)氧化酶或巨噬細胞氧化酶，在先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。吞噬細胞NADPH氧化酶生成的ROS主要起細胞防御功能，而非吞噬細胞中NADPH氧化酶產(chǎn)生的ROS通常作為信號分子，參與機體內(nèi)信號轉導，調(diào)節(jié)細胞分化、增殖、衰老和凋亡等。大量研究證明腫瘤細胞內(nèi)具有比正常細胞較高的ROS，來幫助維系其異常增殖[20～22]。

子宮頸處于特殊位置，接觸和遭受病毒感染機會大。但并不是所有感染HPV的患者都最終發(fā)展成為宮頸癌，因此推測其他因素參與了宮頸癌的發(fā)生。病毒感染可引起人體廣泛的氧化應激反應，使局部組織的ROS水平持續(xù)升高，進一步促進病毒的損傷作用及病毒基因組整合到宿主細胞，導致腫瘤的發(fā)生。有人提出使用抗氧化劑治療腫瘤，但許多抗氧化劑不但沒有抗腫瘤作用，反而促進腫瘤的發(fā)生和轉移[16～18]；而促氧化治療藥物卻取得了很好的治療作用，化療和放療主要通過產(chǎn)生高濃度ROS殺死腫瘤細胞。目前，增加腫瘤細胞內(nèi)ROS水平的藥物逐漸應用于臨床，主要通過增加腫瘤細胞內(nèi)ROS水平加速腫瘤細胞凋亡從而達到治療目的。一些研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞(包括宮頸癌細胞)中ROS和抗氧化物含量均較高，高水平抗氧化物是腫瘤細胞用于抑制高水平的氧化物維持其生長的防御屏障，能提高其抗氧化應激損傷能力[23,24]。本研究結果顯示，H2O2誘導的氧化應激可促進腫瘤細胞凋亡，使用NOX途徑特異性抑制劑可明顯降低HPV陽性宮頸癌細胞的凋亡率。因此，抗氧化治療可能導致腫瘤細胞受益要多于正常細胞，甚至會加速腫瘤的生長和轉移。增加腫瘤細胞內(nèi)氧化物水平，降低抗氧化物質(zhì)表達，使腫瘤細胞抗氧化應激能力下降，可能提高放化療的效果。

綜上所述，不同類型的宮頸癌細胞氧化應激狀態(tài)不同，HPV陽性宮頸癌細胞內(nèi)ROS水平高于陰性宮頸癌細胞。NOX途徑是HPV陽性宮頸癌細胞ROS的主要來源，促氧化治療可能更好地殺傷HPV陽性宮頸癌細胞，為宮頸癌及HPV相關腫瘤的治療提供新靶標。

[1] Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011,61(2):69-90.

[2] De Marco F. Oxidative stress and HPV carcinogenesis[J]. Viruses, 2013,5(2):708-731.

[3] Bauer G. Targeting extracellular ROS signaling of tumor cells[J]. Anticancer Res, 2014,34(4):1467-1482.

[4] Evans M, Powell NG. The changing aetiology of head and neck cancer: the role of human papillomavirus[J]. Clin Oncol (R Coll Radiol), 2010,22(7):538-546.

[5] Scudellari M. HPV: sex, cancer and a virus[J]. Nature, 2013,503(7476):330-332.

[6] Schiffman M, Castle PE, Jeronimo J, et al. Human papillomavirus and cervical cancer[J]. Lancet, 2007,370(9590):890-907.

[7] Viens LJ, Henley SJ, Watson M, et al. Human papillomavirus-associated cancers-united states, 2008-2012[J]. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 2016,65(26):661-666.

[8] Poyton RO, Ball KA, Castello PR. Mitochondrial generation of free radicals and hypoxic signaling[J]. Trends Endocrinol Metab, 2009,20(7):332-340.

[9] Bedard K, Krause KH. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology[J]. Physiol Rev, 2007,87(1):245-313.

[10] Trachootham D, Lu W, Ogasawara MA, et al. Redox regulation of cell survival[J]. Antioxid Redox Signal, 2008,10(8):1343-1374.

[11] Liu VW, Shi HH, Cheung AN, et al. High incidence of somatic mitochondrial DNA mutations in human ovarian carcinomas[J]. Cancer Res, 2001,61(16):5998-6001.

[12] Poppek D, Grune T. Proteasomal defense of oxidative protein modifications. Proteasomal defense of oxidative protein modifications[J]. Antioxid Redox Signal, 2006,8(1-2):173-184.

[13] Ishikawa K, Takenaga K, Akimoto M, et al. ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis[J]. Science, 2008,320(5876):661-664.

[14] Hyoudou K, Nishikawa M, Kobayashi Y, et al. SOD derivatives prevent metastatic tumor growth aggravated by tumor removal[J]. Clin Exp Metastasis, 2008,25(5):531-536.

[15] Hurd TR, DeGennaro M, Lehmann R. Redox regulation of cell migration and adhesion[J]. Trends Cell Biol, 2012,22(2):107-115.

[16] Le Gal K, Ibrahim MX, Wiel C, et al. Antioxidants can increase melanoma metastasis in mice[J]. Sci Transl Med, 2015,7(308):308re8.

[17] Raj L, Ide T, Gurkar AU, et al. Selective killing of cancer cells by a small molecule targeting the stress response to ROS[J]. Nature, 2011,475(7355):231-234.

[18] Piskounova E, Agathocleous M, Murphy MM, et al. Oxidative stress inhibits distant metastasis by human melanoma cells[J]. Nature, 2015,527(7577):186-191.

[19] Marullo R, Werner E, Zhang H, et al. HPV16 E6 and E7 proteins induce a chronic oxidative stress response via NOX2 that causes genomic instability and increased susceptibility to DNA damage in head and neck cancer cells[J]. Carcinogenesis, 2015, 36(11):1397-1406.

[20] Cabello CM, Bair WB 3rd, Wondrak GT. Experimental therapeutics: targeting the redox Achilles heel of cancer[J]. Curr Opin Investig Drugs, 2007,8(12):1022-1037.

[21] Kumar B, Koul S, Khandrika L, et al. Oxidative stress is inherent in prostate cancer cells and is required for aggressive phenotype[J]. Cancer Res, 2008,68(6):1777-1785.

[22] Trachootham D, Alexandre J, Huang P. Targeting cancer cells by ROS-mediated mechanisms: a radical therapeutic approach[J]. Nat Rev Drug Discov, 2009,8(7):579-591.

[23] Ma J, Cai H, Wu T, et al. PALB2 interacts with KEAP1 to promote NRF2 nuclear accumulation and function[J]. Mol Cell Biol, 2012,32(8):1506-1517.

[24] Ma JQ, Tuersun H, Jiao SJ, et al. Functional Role of NRF2 in Cervical Carcinogenesis[J]. PLoS One, 2015,10(8):e0133876.

·作者·編者·讀者·

《山東醫(yī)藥》關于摘要與關鍵詞的說明

論著需附中、英文摘要(包括目的、方法、結果、結論四部分)。中文摘要300～500字，英文摘要400～500個實詞。英文摘要尚應包括文題、作者姓名(漢語拼音)。論著、基礎研究、臨床研究、綜述與講座需標引關鍵詞2～5個，盡量使用美國國立醫(yī)學圖書館編輯的最新版《Index Medicus》中醫(yī)學主題詞表(MeSH)所列的詞。英文關鍵詞中的縮寫詞應按MeSH還原為全稱。

Effect of NOX pathway in oxidative stress-induced apoptosis of cervical cancer cells

WANGJing1,WANGHongtao,MAHua,SUNMeiqun,ZHAOWeidong

(1AnhuiProvincialHospital,Hefei230001,China)

ObjectiveTo investigate the oxidative stress status of different types of cervical cancer cells, and the role of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase (NOX) pathway in oxidative stress-induced apoptosis of cervical cancer cells.MethodsFlow cytometry (FCM) was employed to detect the levels of total reactive oxygen species (ROS) of different types of cervical cancer cells and intracellular ROS levels derived from mitochondrial and NOX pathway before and after treatment with a NOX inhibitor, DPI. After DPI pretreatment and H2O2action, flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of different types of cervical cancer cells.ResultsHPV-positive cells showed higher levels of ROS as compared with HPV-negative cells (P<0.05). No significant difference was found in the mitochondrial pathway-derived ROS level between HPV-negative cells and HPV-positive cells (P>0.05). NOX inhibitor DPI significantly reduced ROS level in HPV-positive cells as compared with that before treatment (P<0.05). Compared with the control group and the HPV-negative cells, the apoptosis rate of HPV-positive cells increased after H2O2induction and was higher than that of HPV-positive cells group with DPI pretreatment and with DPI pretreatment + H2O2induction.ConclusionNOX pathway plays an important role in the process of HPV inducing cervical cancer, and pro-oxidant treatment may be more effective in killing HPV-positive cervical cancer cells.

cervical carcinoma; human papilloma virus; stress; reactive oxygen species; nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase

安徽高校自然科學基金重點項目(KJ2016A472)。

王井(1983-)，女，本科，主治醫(yī)師，主要研究方向為腫瘤免疫。E-mail： 119877366@qq.com

趙衛(wèi)東(1970-)，男，博士，主任醫(yī)師，博士生導師，主要研究方向為婦科腫瘤。E-mail： victorzhao@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.20.004

R737.33

A

1002-266X(2017)20-0013-04

2016-09-06)