莪術石油醚提取物對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231轉移相關基因影響的體外研究

錢 祥 甄宏德 李永峰 張愛琴，3

莪術石油醚提取物對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231轉移相關基因影響的體外研究

錢 祥1甄宏德2李永峰1張愛琴1，3

目的觀察莪術石油醚提取物（PECZ）對三陰性乳腺癌細胞增殖、細胞趨化因子及黏附因子的影響，觀察其對三陰性乳腺癌細胞轉移相關基因的甲基化作用。方法以三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231作為研究對象，采用CCK-8法檢測藥物對細胞株的增殖抑制作用，RT-PCR法檢測藥物對黏附因子E-cadherin、E-selectin和趨化因子SDF-1、CXCR4 mRNA表達量的影響，MSHRM法檢測藥物對黏附因子E-cadherin的啟動子甲基化水平的影響。結果（1）與空白對照組零抑制率比較，不同濃度的表阿霉素組（抑制率為47.2%～68.8%）及PECZ組（抑制率為23.8%～80.2%）對細胞增殖均有一定的抑制作用，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。（2）與空白對照組趨化因子和黏附因子的（1±0）表達量比較，300μg/mL濃度的PECZ干預細胞24h后，細胞趨化因子CXCR4 mRNA（0.63±0.07）的表達降低，趨化因子SDF-1 mRNA（1.13±0.21）和細胞黏附因子E-selectin mRNA（2.73±1.92）表達提高，并顯著提高細胞黏附因子E-cadherin mRNA（13.35±3.43）的表達，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。（3）與空白對照組、低劑量PECZ組100%甲基化率比較，高劑量PECZ組甲基化率為80%～90%，明顯降低乳腺癌細胞黏附因子E-cadherin啟動子的甲基化水平（P＜0.05）。結論莪術石油醚提取物對乳腺癌細胞具有一定的抑制作用，其對細胞轉移和侵襲的抑制作用可能是通過上調細胞黏附因子E-cadherin mRNA的表達實現。高濃度莪術石油醚提取物對乳腺癌細胞黏附因子E-cadherin抑癌基因的啟動子具有一定的去甲基化作用。

三陰性乳腺癌細胞；莪術石油醚提取物；甲基化；細胞轉移

乳腺癌是女性最常見惡性腫瘤之一，其每年發病率和死亡率居我國女性惡性腫瘤的首位[1]。乳腺癌是一種生物學特征高度異質性的惡性腫瘤，雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和HER-2表達在免疫組化上均不表達者，稱之為三陰性乳腺癌（TNBC）。TNBC較非TNBC者，具有組織學分級高、惡性程度高、復發率高、總生存期短等特點。對于乳腺癌復發轉移，中醫多從毒、從痰、從瘀論治，祛痰化瘀散結解毒中藥對抑制乳腺癌的復發轉移有較好效果[2]。因此，臨床治療乳腺癌復發轉移，較多選擇具有祛痰化瘀解毒的抗癌中藥，如蛇六谷、莪術、制南星、山海螺等。莪術屬姜科類植物，為溫郁金的干燥根莖，其主要的功效為活血化瘀、行氣止痛、破血消癥，常被應用到乳腺癌的治療[3]。從提取的工藝來分類，莪術提取物包括莪術石油醚提取物（PECZ）、莪術乙酸乙酯提取物（EACZ）、莪術正丁醇提取物（NBCZ）以及莪術水提取物。已有研究[4]顯示，不同莪術提取物對乳腺癌均有一定的抑制作用，其中PECZ抑制作用最強。國內動物實驗結果顯示，莪術抗癌作用的機制與影響細胞增殖[5]、促進腫瘤細胞凋亡[6]、調控端粒酶酶活性[7]和抑制血管生成[8]等有關。本實驗通過觀察莪術石油醚提取物對三陰性乳腺癌細胞E—cadherin基因啟動子的甲基化作用，進一步探討莪術抗乳腺癌轉移的作用機制。

1 實驗材料

1.1 試劑與藥品RPMI-1640培養基內含15%的小牛血清和10μg/mL人胰島素；消化液（0.25%胰酶和0.02%EDTA按1：1混合）；碘化丙啶溶液、二甲基亞砜（DMSO）為SIGMA公司產品；PBS液；MS-HRM檢測試劑SsoFast Eva Green Supermix（飽和染料qPCR試劑）購自Bio-Rad公司；甲基化標準品EpiTect PCR Control DNA Set（100）Cat.No-59695；SuperScript反轉錄酶及其緩沖液（GibcoBRL）；TaqDNA聚合酶及其緩沖液（Roche）；dNTP（Roche）；莪術由浙江省腫瘤醫院中藥房提供（華東醫藥有限公司）；表阿霉素10mg（浙江海正藥業股份有限公司）。

1.2 實驗器材電熱恒溫水槽（DKB-8A型，上海精密實驗設備有限公司）、離心機（LDZ5-2型）、CO2培養箱（Heraeus，B5660-EK）、顯微鏡（OLMPUS）、吸管、超凈臺、35mL培養瓶、CCK-8 Kit（細胞計數CCK8試劑盒）為日本DOJINDO公司產品；細胞/組織基因組DNA提取試劑盒：GK0221，上海捷瑞生物科技有限公司；RNA/DNA核酸定量儀（Pharmacia-Biotech USA）；實時熒光PCR儀器LightCycler（Roche）及配套軟件；OD值測量儀器（高精度分光光度計）為Merinton SMA4000；定量PCR儀為CFX connect Real-Time PCR System，配套使用的分析軟件為Precision Melt Analysis（用于HRM分析）；相關耗材（Tip頭、EP管等）。

1.3 實驗細胞人三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231由浙江省腫瘤研究所惠贈。用15%胎牛血清和100U/mL青霉素、100g/mL鏈霉素、2mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI1640培養液，在37℃細胞培養箱培養備用。

2 方法

2.1 細胞培養細胞用含15%小牛血清（LOT批號1418110）、100U/mL青霉素、100g/mL鏈霉素和10μg/ mL胰蛋白酶-EDTA消化液（LOT批號20150414）的RPMI-1640培養基于35mL的培養瓶中進行傳代培養。培養條件為37℃，5%CO2，90%相對濕度。

2.2 細胞收集將培養瓶中的細胞按常規方法消化收集細胞，1000r/min下離心5min，棄上清液，加入PBS液洗一遍，細胞株制成1×106/mL的細胞懸液。

2.3 莪術石油醚提取物及表阿霉素的制備與配制精密稱取干燥的莪術飲片40g，粉碎成粗顆粒，70%乙醇浸泡過夜后熱回流提取2次。2次提取液合并減壓濃縮，回收乙醇至無醇后以石油醚萃取，回收萃取物。提取成分過濾除菌，濃縮至浸膏，按極性得到莪術石油醚提取物。精密稱取提取物5mg，溶解于500μL二甲基亞砜中，旋渦震蕩，待全部溶解后，0.22μm過濾器過濾，少量分裝后－20℃保存，其濃度均為10mg/mL。臨用前用培養液稀釋至所需濃度。表阿霉素（10mg每支）溶于5mL注射用滅菌用水，其終濃度為2mg/mL，臨用前配制，4℃保存。

2.4 CCK－8法檢測莪術石油醚提取物對細胞增殖作用的影響取對數生長期細胞，以RPMI－1640培養液稀釋至濃度約1×104/mL，接種于96孔板，200μL/孔。常規培養24h后，分別加入100、200、300和400μg/mL莪術石油醚提取物，同時設空白對照組和表阿霉素陽性對照組，表阿霉素濃度分別為0.25、0.5、1和2μg/mL。每濃度設3個復孔，于37℃飽和濕度培養箱中繼續培養24h后，每孔加入CCK8 10μL（5mg/mL），繼續孵育2～4h。用酶標儀在450nm波長處測其吸光度值（OD值）。細胞生長抑制率=（空白組平均值-藥物組平均吸光度值）/（空白組平均值-培養液組平均吸光度值）×100%。

2.5 流式細胞儀檢測莪術石油醚提取物對細胞趨化因子及黏附因子的影響收集對數生長期MDAMB-231細胞，分4份等量傳代于10mL培養瓶，常規培養24h后，換用單純RPMI-1640培養，將配置好的莪術石油醚提取物加入其終濃度為300μg/mL，并設生理鹽水作為陰性對照，設表阿霉素為陽性對照組，濃度為0.25μg/mL，常規培養24h。在藥物作用24h后直接用TRIzoI收集細胞備用。采用TRIzol—步法提取total RNA。

PCR擴增，擴增引物如下：

2.6 甲基化實驗流程收集對數生長期MDA-MB-231細胞，分別分3份等量傳代于10mL培養瓶，常規培養24h后，換用單純RPMI-1640培養，將配置好的莪術石油醚提取物加入其終濃度為300μg/mL（高劑量組）、100μg/mL（低劑量組），并設生理鹽水作為陰性對照，常規培養24h，在藥物作用24h后直接用TRIzoI收集細胞備用。通過引物預實驗，篩選最佳序列；確定（CDKN2A_296F+CDKN2A_296R）引物對檢測p16啟動子甲基化水平。

PCR擴增反應體系：SsoFast Eva Green Supermix 10μL，Forward primer，10μM 1μL，Reverse primer，10μM 1μL，ddH2O 6μL，Template 1μL。

qPCR實驗參數：98.0°C for 2:00；98.0°C for 0: 02；57.0°C for 0:05 Plate Read；GOTO 2,35 more times；Melt Curve 65°C to 95°C:Increment 0.2°C for 0:05Plate Read

2.7 統計學方法所有數據輸入計算機，應用SPSS 16.0統計軟件分析處理，每組OD值以（x±s） 表示，多個樣本單因素方差分析（q檢驗）。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 莪術石油醚提取物對細胞體外增殖的影響與空白對照組比較，表阿霉素組、莪術石油醚提取物各濃度組對MDA-MB-231細胞生長均有明顯抑制作用，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表1，圖1～4（插頁）。

表1 各組MDA-MB-231細胞體外增殖抑制率比較（x±s）

3.2 莪術石油醚提取物對細胞趨化因子及黏附因子的影響RT-PCR實驗結果表明，與空白對照組比較，300μg/mL濃度的莪術石油醚提取物作用24h后細胞，其可降低細胞趨化因子CXCR4 mRNA表達（P＜0.05），提高趨化因子SDF-1 mRNA和細胞黏附因子E-selectin mRNA表達（P＜0.05），并顯著提高細胞黏附因子E-cadherin mRNA表達（P＜0.01）。與表阿霉素組比較，莪術石油醚提取物組E-cadherin mRNA顯著上調（P＜0.05），說明莪術石油醚提取物組對MDA-MB-231細胞轉移和侵襲的抑制作用可能源于對E-cadherin mRNA的調控。見表2，圖5（插頁）。

表2 各組細胞趨化因子SDF-1、CXCR4和黏附因子E-cadherin、E-selectin mRNA表達比較（x±s）

3.3 莪術石油醚提取物對細胞黏附因子E-cadherin基因啟動子的甲基化作用空白對照組和低劑量藥物組樣本的CDH1啟動子（E-cadherin基因）甲基化程度為100%，即E-cadherin基因啟動子完全不表達；高劑量藥物組的3個樣本CDH1啟動子甲基化程度80%～90%，即E-cadherin基因啟動子出現去甲基化現象。見圖6～8（插頁）。

4 討論

TNBC侵襲性強，易出現復發轉移，是預后最差的一種特殊乳腺癌類型。因此，降低乳腺癌細胞侵襲轉移是治療的重中之重。Gould Rothberg等[9]研究表明，乳腺癌中上皮型鈣黏素（E-cadherin）的表達下降與腫瘤轉移相關。

腫瘤屬中醫“癥瘕”、“積聚”范疇，莪術具有活血化瘀、破血消癥的功效。本實驗結果表明，PECZ能顯著提高細胞黏附因子E-cadherin mRNA表達，其對乳腺癌細胞轉移和侵襲的抑制作用可能源于其對E-cadherin mRNA的調控作用。

腫瘤DNA異常甲基化包括抑癌基因啟動子區的高甲基化及某些癌基因啟動子區的低甲基化，前者占甲基化異常的大多數，指基因啟動子區CpG島的異常甲基化致使許多抑癌基因沉默而失活。研究表明，抑癌基因啟動子異常甲基化在人類多種腫瘤包括鼻咽癌、肺癌、肝癌、胃癌、腸癌、乳腺癌等的發病過程中起到重要作用。多種抑癌基因包括P16、E-cadherin、RASSF1A和BRCA1等已被證實由啟動子高甲基化致其沉默，參與腫瘤發生發展的多種生物學過程，如DNA修復、細胞周期、細胞黏附、細胞凋亡和血管生成。E-cadherin是一種重要的細胞一細胞間黏附分子，E-cad表達降低的腫瘤更易發生侵襲和轉移。相關研究表明，細胞黏附因子E-cadherin基因（CDHl啟動子）5’區CpG島甲基化可出現在乳腺癌細胞中，且這種甲基化在一定條件下是可逆的[10]。本實驗通過甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析空白對照組、低劑量藥物組、高劑量藥物組中乳腺癌細胞E-cadherin基因（CDHl啟動子）甲基化的差異，結果顯示空白對照組和低劑量藥物組樣本的CDH1啟動子甲基化程度為100%，即E-cadherin基因啟動子完全不表達；而高劑量藥物組CDH1啟動子甲基化程度低于100%，即E-cadherin基因啟動子出現去甲基化現象。我們進一步推測莪術石油醚提取物作用于三陰性乳腺癌細胞后，E-cadherin基因啟動子出現去甲基化作用，E-cadherin mRNA部分表達，抑制細胞侵襲與轉移。本研究結果顯示，莪術石油醚提取物對細胞中CDH1啟動子具有一定的去甲基化作用，但此結果僅僅是其抗腫瘤機制中的冰山一角，啟動子異常甲基化可使腫瘤細胞中多種信號通路紊亂。例如上皮黏附因子E-cadherin可與β-catenin結合，抑制其聚集在核內而影響β-catenin影響細胞內定位，致Wnt/β-catnin信號通路異常活化。對于多條信號通路以及相關信號因子的傳遞仍有待進一步探索。

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（收稿：2016-10-27修回：2017-01-19）

Effect of Petroleum Ether Extracts of Curcuma Zedoaria on Metastasis-associated Genes of Triple Negative Breast Cancer Cells in vitro

QIAN Xiang1,ZHEN Hongde2,LI Yongfeng1,ZHANG Aiqin1,3
1 Department of Chinese Medicine Medical Center,Zhejiang Cancer Hospital,Hangzhou(310022)；2 Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053);3 Zhejiang Integrative Oncology Key Laboratory,Hangzhou(310022)

ObjectiveTo investigate the effect of petroleum ether extract of Curcuma zedoaria（PECZ）on proliferation,chemokines,and adhesion factors in triple negative breast cancer cell MDA-MB-231.MethodsMDAMB-231 cells were treated with various concentrations of PECZ;cellular viability was detected with CCK-8 method, the mRNA expressions of E-cadherin,E-selectin and SDF-1,CXCR4 with RT-PCR,and the methylation of E-cadherin promoter with MS-HRM analyses.ResultsCompared with the blank control group,MDA-MB-231 cells were inhibited by PECZ（the inhibitory rate were from 23.8%-80.2%）and epirubicin（the inhibitory rate were from 47.2%-68.8%）,with P＜0.05;the CXCR4 mRNA expression level was decreased at 24h after treated with PECZ at the concentration of 300μg/mL and the mRNA expressions of E-cadherin,E-selectin and SDF-1 were increased（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with the blank control group and low-dose group（100μg/mL）,high-dose（300μg/ mL）PECZ reduced the level of methylation on E-cadherin promoter to 80%-90%（P＜0.05）.ConclusionPECZ can inhibit the proliferation,metastasis and invasion of breast cancer cells possibly by upregulating the expression of E-cadherin mRNA.In methylation level,PECZ has some demethylation function on E-cadherin promoter.

triple negative breast cancer cell;petroleum ether extracts of curcuma zedoaria;methylation;cellmetastasis

浙江省中醫藥科技計劃項目（No.2016ZA034、2016ZB023）

1浙江省腫瘤醫院名中醫館（杭州310022）；2浙江中醫藥大學（杭州310053）；3浙江省中西醫結合腫瘤重點實驗室（杭州310022）

張愛琴，Tel：0571-88122245；E-mail：zhanghaojianbb@163.com