柳葉白前多糖、醇溶性浸出物含量測定與相關(guān)性分析

潘晨曦 陳健苗 呂偉旗

·藥學研究·

柳葉白前多糖、醇溶性浸出物含量測定與相關(guān)性分析

潘晨曦 陳健苗 呂偉旗

柳葉白前；多糖；浸出物；相關(guān)性分析

柳葉白前系蘿藦科植物柳葉白前Cynanchum stauntonii（Decne.）Schltr.ex.Levl.的干燥根莖，是2015版《中國藥典》收錄的兩種白前藥材之一，產(chǎn)于安徽、江蘇、浙江、湖南、江西、福建、廣東、四川、廣西和貴州等省區(qū)，性辛、苦、微溫，具有降氣，消痰，止咳的功效，用于肺氣壅實，咳嗽痰多，胸滿喘急[1-3]。柳葉白前現(xiàn)有研究主要集中在根部揮發(fā)油、甾體類等成分分離鑒定及其抗菌、抗病毒等藥理藥化作用，藥材偽品生藥學鑒定與高效優(yōu)質(zhì)栽培技術(shù)研究等方面，對不同產(chǎn)地柳葉白前種質(zhì)資源收集與評價工作鮮有報道[4-9]。藥用植物中提取的多糖具有抗腫瘤、抗病毒、提高免疫力，抗氧化等多種功效，研究表明柳葉白前根部醇提物具有鎮(zhèn)咳平喘、鎮(zhèn)痛抗炎、抗血栓形成等作用[10-14]，因此本試驗收集全國柳葉白前主分布區(qū)18個種質(zhì)資源，以多糖與醇溶性浸出物為含量指標，分析其與產(chǎn)地、經(jīng)緯度、海拔、農(nóng)藝性狀間的相關(guān)性，以期為柳葉白前種質(zhì)資源質(zhì)量評價與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料2013年11月—2014年1月，收集浙江、江西、福建等省柳葉白前種質(zhì)資源18份，2014年3月將收集的種子統(tǒng)一播種，同年5月待苗高15 cm左右時統(tǒng)一移栽于我院中藥材種質(zhì)資源圃，常規(guī)大田水肥管理。原植物由陳健苗副主任藥師鑒定為蘿藦科植物柳葉白前C.Stauntonii，見表1。

1.2 儀器與試劑Milli-Q Academic超純水儀（美國Millipore公司）；UV2550紫外-可見分光光度計（上海第三分析儀器廠）；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司）；DGG-9070型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）；DSH-9070型高溫干燥試驗箱（杭州藍天化驗儀器廠）；GT16-3型高速臺式離心機（北京時代北利離心機有限公司）；FA1004B型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）。D（+）-無水葡萄糖（B21882）購自上海源葉生物科技有限公司；重蒸酚（909C024）購自北京索萊寶科技有限公司，濃硫酸（81007）購自深圳市冠泰化工有限公司，其它試劑均為分析醇。

表1 供試柳葉白前種質(zhì)資源

1.3 試驗方法

1.3.1 農(nóng)藝性狀考察2015年10月考察農(nóng)藝性狀，每個處理隨機選取15株，用卷尺與游標卡尺測量株高、莖粗、葉長、葉寬、根狀莖長、根狀莖直徑與根狀莖節(jié)間長，計算葉長寬比=葉長/葉寬，葉長寬積=葉長×葉寬；采挖地下根狀莖，以10m2小區(qū)所有植株地下根狀莖干重為產(chǎn)量指標，試驗平行3次。

1.3.2 多糖與浸出物含量測定

1.3.2.1 樣品溶液制備與含量測定多糖含量測定采用苯酚-硫酸法，參考2015版《中國藥典》[1]：精密稱取柳葉白前粉末0.3g，加蒸餾水200mL，沸水浴回流提取3h，趁熱過濾定容至250mL，精密吸取5mL，加25mL無水乙醇，4℃放置1h，4000rpm離心1h，倒去上清，加80%乙醇20mL，4000rpm離心30min，重復1次，沉淀定容至50mL。取樣品溶液1mL，加5%苯酚溶液1mL，濃硫酸5mL，搖勻冰浴放置5min，沸水浴20min，冷卻至室溫，于488nm處測定吸光度，以蒸餾水為對照，試驗平行3次。

醇溶性浸出物含量測定采用熱浸法，參考2015版《中國藥典》[1]：精密稱取柳葉白前粉末2.0g，加95%乙醇50mL，密塞稱重得質(zhì)量b，放置1h，80℃加熱回流提取1h，補差重，精密量取濾液25mL置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后105℃干燥3h，干燥器內(nèi)冷卻稱重得質(zhì)量a，計算浸出物含量=（a－b）×

1.3.2.2 線性關(guān)系考察精密吸取0.1mg/mL葡萄糖標準品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1/mL，蒸餾水補足2mL，按照“1.2.2.1”方法測定吸光度，以吸光度為縱坐標Y，濃度為橫坐標X，繪制標準曲線，本試驗線性方程為Y=13.856X－0.0166，R2=0.9997，濃度范圍為0.005～0.05mg/mL。

1.3.2.3 穩(wěn)定性試驗取浙江松陽樣品，在“1.3.2.1”方法下制備樣品溶液，室溫避光保存，分別在0、1、2、4、8、12、24h測定OD值，計算RSD為1.21%，供試多糖樣品溶液在室溫避光保存24h穩(wěn)定。

1.3.2.4 重復性試驗取浙江松陽樣品6份，在“1.3.2.1”方法下制備樣品溶液與測定多糖含量，得樣品平均多糖含量為8.13%，RSD為2.27%，試驗方法重復性良好。

1.3.2.5 精密度試驗取浙江松陽樣品溶液，按“1.3.2.1”方法下連續(xù)測定6次吸光度，得RSD為0.17%，表明儀器精密度良好。

1.3.2.6 加樣回收率試驗取浙江松陽樣品適量，加入葡萄糖標品，在“1.3.2.1”方法下制備樣品溶液，配制成80%、100%、120%的低、中、高3個濃度梯度分別測定多糖含量，計算加樣回收率（%）=（C-A）/B× 100%，A為樣品多糖含量，B為加入標準品含量，C為實際測得量，試驗平行3次，得平均加樣回收率與RSD值，見表2。

1.3.2.7 數(shù)據(jù)處理應用SPSS17.0與DPS9.05軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素ANOVA分析，聚類分析采用類平均法。

2 結(jié)果

2.1 不同種質(zhì)間多糖、醇溶性浸出物與農(nóng)藝性狀比較18個柳葉白前種質(zhì)間多糖、醇溶性浸出物含量、農(nóng)藝性狀均存在極顯著差異（P＜0.01）。其中，廣東陽山種質(zhì)株高、莖粗、葉寬、葉長寬積，浙江臨安種質(zhì)葉長，四川峨眉山種質(zhì)葉長寬比，江蘇金壇種質(zhì)根狀莖長、根狀莖產(chǎn)量，福建浦城種質(zhì)根狀莖直徑，浙江松陽種質(zhì)根狀莖節(jié)間長指標最高，分別達到103.66cm、2.41mm、1.18cm、7.09cm2、6.03cm、8.72、7.21cm、3.12 kg/10m2、3.21mm與3.85cm；供試柳葉白前多糖平均含量為6.54%，浙江建德種質(zhì)多糖含量最高，達8.50%，安徽祁門種質(zhì)含量最低，僅為3.84%；醇溶性浸出物平均含量為10.16%，浙江臨海種質(zhì)含量最高，達12.85%，江蘇溧陽種質(zhì)最低，僅為8.20%，見表3；相關(guān)性分析顯示，柳葉白前多糖含量與莖粗、葉長、葉長寬比、根狀莖直徑、根狀莖間節(jié)長、產(chǎn)量指標呈顯著正相關(guān)，與葉寬、根狀莖長、海拔相關(guān)性較低；浸出物含量與葉長、葉長寬比、根狀莖直徑與產(chǎn)量指標呈顯著正相關(guān)，與葉寬、根狀莖長呈負相關(guān)，與經(jīng)緯度、海拔相關(guān)性較低，見表4。

2.2 主成分分析與優(yōu)良種質(zhì)篩選主成分分析顯示12個供試性狀可簡化為5個主性狀成分，累計貢獻率達91.21%。其中，第1主成分特征根值為5.3250，貢獻率為44.37%，株高、莖粗、葉長、葉寬、葉長寬積與產(chǎn)量指標特征向量較大，且為正值，構(gòu)成本成分主要變異來源；第2主成分特征根值為2.7076，貢獻率為22.56%，多糖含量、浸出物含量、葉長寬比為主要變異來源。見表5。以第1主成分Y（i，1）＞0且Y（i，2）＞0為入選標準，篩選出浙江建德、浙江臨安、浙江臨海與浙江松陽4個優(yōu)良種質(zhì)，表現(xiàn)出生長勢好，根狀莖發(fā)達，多糖與浸出物含量高等優(yōu)良性狀。見表6。

表2 加樣回收率試驗（n=3）

表3 供試柳葉白前農(nóng)藝性狀、多糖與浸出物含量比較（n=15）

表4 多糖、浸出物含量與農(nóng)藝性狀、經(jīng)緯度、海拔間相關(guān)性分析

表5 入選主成分的特征根值、貢獻率、累計貢獻率與特征向量

表6 入選優(yōu)良種質(zhì)的主成分值

2.3 聚類分析按照類平均法，依據(jù)D2=7.19的聚類水平，將18個供試柳葉白前種質(zhì)分為4大類（圖1）。第Ⅰ類群共5個種質(zhì)，以浙江種質(zhì)為主，分別為浙江建德、浙江松陽、四川峨眉山、浙江臨海與浙江上虞，該類群植株較高或中等高度，莖較粗，葉中等大小較狹長，根狀莖產(chǎn)量高，多糖與浸出物含量高，篩選的大部分優(yōu)良種質(zhì)歸在此類；第Ⅱ類群共5個種質(zhì)，分別為浙江蓮都、福建蕉城、江蘇金壇、江蘇溧陽與廣東陽山，該類群植株較高或中等高度，莖較粗，葉片大而寬厚，根狀莖產(chǎn)量高，但多糖與浸出物含量較低；第Ⅲ類群共4個種質(zhì)，分別為浙江臨安、江西資溪、福建浦城與安徽休寧，該類群浙江臨安種質(zhì)植株生長勢好，根狀莖產(chǎn)量于成分指標均表現(xiàn)較好，其余種質(zhì)植株較矮，莖較細，多數(shù)葉片小而狹長，根狀莖產(chǎn)量低，多糖與浸出物指標表現(xiàn)一般；第Ⅳ類群共4個種質(zhì)，分別為江西臨川、廣西馬山、安徽祁門與廣西田林種質(zhì)，該類群植株中等高度或較矮，莖較細，葉片大多小而寬厚，根狀莖產(chǎn)量低，多糖與浸出物含量較低。

圖1 柳葉白前種質(zhì)聚類分析圖

3 討論

供試柳葉白前不同種質(zhì)間農(nóng)藝性狀、多糖與醇溶性浸出物含量存在極顯著差異（P＜0.01），表現(xiàn)出較豐富的遺傳多樣性，可作為良種選育的種質(zhì)材料；柳葉白前多糖、醇溶性浸出物含量與產(chǎn)地、農(nóng)藝性狀關(guān)系密切，與葉長、葉長寬比、根狀莖直徑與產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)，各產(chǎn)地中浙江、四川種質(zhì)多糖與醇溶性浸出物含量較高，其次為江西、廣東、廣西種質(zhì)；12個供試性狀可簡化為5個主成分性狀，累計貢獻率為91.21%，其中第1主成分主要為農(nóng)藝性狀產(chǎn)量指標，以葉長寬比與根狀莖產(chǎn)量為主，第2主成分為多糖、浸出物含量指標；18個種質(zhì)可劃分為4個類群，其中類群Ⅰ植株較高，莖較粗，地下部根狀莖發(fā)達，多糖與浸出物含量高，總體表現(xiàn)較好；柳葉白前良種選育時，可優(yōu)先在根狀莖發(fā)達，高葉長寬比的浙江建德、浙江臨安、浙江臨海與浙江松陽種質(zhì)中選擇。

2015年版《中國藥典》對白前藥材質(zhì)量暫無定量標準規(guī)定，本試驗柳葉白前多糖與醇溶性浸出物含量為6.54%與10.16%，可為后續(xù)柳葉白前藥材質(zhì)量標準制訂提供參考。中藥材產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境包括水、土壤、生物、氣候等環(huán)境因子，在中藥材生長發(fā)育過程中各環(huán)境因子間相互影響與關(guān)聯(lián)，本試驗對不同區(qū)域的海拔與柳葉白前多糖、醇溶性浸出物含量進行了初步考察，下一步將在優(yōu)良種質(zhì)篩選的基礎(chǔ)上，開展同一區(qū)域內(nèi)不同海拔對柳葉白前活性成分積累的影響分析，以減少環(huán)境因子間互作關(guān)聯(lián)性的影響。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2015年版一、四部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：109-110，283，202．

［2］中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志（第63卷）［M］.北京：科學出版社，1977：337．

［3］梁愛華，薛寶云，楊慶，等.柳葉白前的鎮(zhèn)咳、祛痰及抗炎作用［J］.中國中藥雜志，1996，21（3）：173-177．

［4］鄭聲祥.柳葉白前化學成分研究［J］.中國中藥雜志，1994，19（8）：488-490．

［5］田效民，李鳳，黃順菊，等.柳葉白前揮發(fā)性成分的GC-MS分析［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19（5）：111-113．

［6］余舒樂，馬林，吳正鳳，等.柳葉白前中非C21甾體類化學成分［J］．中國藥科大學學報，2015，46（4）：426-430．

［7］Zai-Chang Y，Bo-Chu W，Xiao-Sheng Y，et al.Chemical composition of the volatile oil from Cynanchum stauntonii and its activities of anti-influenza virus［J］.Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2005，43（3-4）：198-202.

［8］陳宏康，萬美亮，劉國杜，等.提高柳葉白前產(chǎn)量和質(zhì)量的探討［J］．中國中藥雜志，1995，20（4）：204-207．

［9］萬定榮，葛建平，馮海龍，等.中藥白前的栽培品與野生品質(zhì)量及鑒別比較［J］．中國醫(yī)院藥學雜志，1988，8（1）：2-3．

［10］黃芳，方悅，鄭琦，等.白前抗血栓形成作用的研究［J］.浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，22（7）：574-575．

［11］梁愛華，薛寶云，楊慶，等.白前與白薇的部分藥理作用比較研究［J］．中國中藥雜志，1996，21（10）：622-626．

［12］沈雅琴，張明發(fā)，朱自平，等.白前的鎮(zhèn)痛、抗炎和抗血栓形成作用［J］．中國藥房，2001，12（1）：15-16．

［13］薛愛珍，鄧旻，史亦謙.中藥多糖促誘生細胞因子的研究進展［J］．浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，17（1）：64-66．

［14］丁潔平，王慧銘，孫煒.生物多糖抗腫瘤作用機制研究進展［J］．浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，19（8）：517-519．

（收稿：2016-12-12修回：2017-01-10）

浙江省麗水市人民醫(yī)院藥劑科（麗水323000）

陳健苗，Tel：0578-2780083；E-mail:lstracy1027@163.com