膽固醇代謝紊亂SD大鼠肝細胞膜生物泵糠蛋白表達的平行對照分析

余靜喜

[摘要] 目的 分析膽固醇代謝紊亂的SD大鼠肝細胞膜生物泵糖蛋白（Pgp）及相關生化指標與正常大鼠的差異性。 方法 選取SD大鼠30只，隨機均分為對照組與觀察組，每組各15只；觀察組大鼠以高脂飼料喂養法制備為膽固醇代謝紊亂模型，對照組大鼠常規喂養保持健康；以免疫組化法分析兩組大鼠肝臟Pgp表達水平并進行比較，同時比較兩組大鼠肝勻漿的各項相關生化指標。 結果 對照組大鼠肝臟Pgp平均光度值為（1.01±0.13），肝指數為（1.69±0.68）；觀察組大鼠肝臟Pgp平均光度值為（5.36±1.21），肝指數（3.35±0.37）；觀察組肝臟Pgp平均光度值與肝指數均顯著高于對照組（P<0.01）。觀察組肝臟脂肪病變+++的發生率為53.33%，對照組無+++級別肝臟脂肪病變發生，觀察組整體肝臟脂肪病變程度較對照組嚴重（P<0.01）。觀察組與對照組大鼠初始體質量、肝勻漿TBA，差異無統計學意義（P>0.05）；觀察組與對照組大鼠血清Tch比較差異有統計學意義（P<0.05）；兩組其他各項指標均差異具有統計學意義（P<0.01）。肝臟脂肪病變程度與肝臟Pgp光度值呈顯著高度正相關性，0.8

[關鍵詞] 膽固醇代謝紊亂；P-糖蛋白；肝臟；內分泌

[中圖分類號] R259 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2017）07-09-04

Parallel control analysis of Biological pump glycoprotein expression of SD rat liver cell membrane with cholesterol metabolism disorder

YU Jingxi

Department of General Surgery，the Third People's Hospital of Huizhou，Huizhou 516002，China

[Abstract] Objective To analyze the difference of Biological pump glycoprotein （Pgp） of SD rat liver cell membrane with cholesterol metabolism disorder and its related biochemical indexes and the normal rats. Methods 30 SD rats were selected and randomly divided into observation group and control group，15 rats in each group.The rats in observation group fed with high fat diet were prepared for the disorder of cholesterol metabolism in model，and rats of control group fed healthy.Immunohistochemical method was used to analyze the expression of Pgp in two groups of rats. And they were compared.The related biochemical indexes of rat liver homogenate of the two groups were also compared. Results The average Pgp value of rat liver of control group was （1.01±0.13），the liver index was （1.69±0.68）.The average Pgp value of rat liver of observation group was （5.36±1.21），the liver index was （3.35±0.37）.The average Pgp value of rat liver and liver index in observation group group were significantly higher than those of control group （P<0.01）.The hepatic steatosis +++ incidence rate of observation group was 53.33%，the control group had no pathological changes of liver fat level +++.The observation group overall hepatic steatosis degree was more serious than the control group， （P<0.01）.There were no statistical differences on rats initial body weight and liver homogenate TBA between the observation group and the control group （P>0.05）.There was some statistical difference on rats serum Tch between observation group and control group（P<0.05）.The other indexes showed statistically significant differences，（P<0.01）.There was a significant positive correlation between the degree of hepatic steatosis and Pgp value of liver，0.8

[Key words] Cholesterol metabolism disorder；P-glycoprotein；Liver；Endocrine

肝臟是人體代謝膽固醇的主要臟器，也是唯一具有大規模清除膽固醇的臟器[1-3]。多數高脂血癥的患者通常合并有肝內的脂肪沉淀積聚，可對患者的肝功能造成損傷，從而進一步加劇膽固醇代謝的紊亂程度。Pgp為ATP結合盒超系列成員，于肝細胞膜上可見高表達，并參與至膽汁酸的形成與轉運過程當中[4-6]。本研究旨在通過動物模式觀察膽固醇代謝紊亂大鼠的Pgp蛋白的表達變化以及肝細胞脂肪的病變情況，以為膽固醇代謝紊亂的防治提供新的依據。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2015年3月自中山大學實驗用動物中心購買SD雄性大鼠30只，隨機分為對照組與觀察組，每組各15只。兩組大鼠月齡均為8～12個月，兩組大鼠的年齡結構等無統計學意義（P>0.05）。具有可比性。適應性喂養時全部大鼠均食水自由，自然光照，室溫控制在18～25℃，相對濕度保持在40%～50%，每日上午加水、喂食并更換墊料。對照組大鼠給予嚙齒類動物標準飼料，確保大鼠健康，在足夠范圍內自由活動。觀察組大鼠給予高脂飼料喂養，高脂飼料由嚙齒類動物標準飼料86.3%、豬油5%、蛋黃粉8%、膽酸鈉0.2%、膽固醇0.5%組成，縮小大鼠活動范圍盡量減少大鼠運動。兩組均喂養4周。

1.2 觀察方法

采集兩組大鼠眼底靜脈血樣3mL；立即處死，剖取肝臟，放入冷生理鹽水當中充分漂洗，以濾紙完全吸干，以肉眼觀察大鼠的外觀并稱取質量，依肝質量（g）/體質量（g）×100%公式計算肝指數。將肝臟分為兩部分，其中一部分肝臟以甲醇-氯仿以1∶1比例制備為100g/L的肝臟組織勻漿，使用離心機以2000r/min速度離心后取得上層上清液待檢；另一部分肝臟組織以100g/L甲醛溶液完全固定，使用石蠟包埋制作切片。所制作的石蠟切片以HE染色后于光鏡下觀測肝臟脂肪的變程度，以肝小葉中的含脂滴細胞數量/總細胞數量計算的結果作為判斷肝細胞脂肪病變的程度，以0為-、以<1/3為+、以1/3～2/3為++、以>2/3為+++。

檢測并比較對照組與觀察組大鼠肝組織當中Pgp的表達水平，使用免疫組化測定，一抗使用羊抗鼠Pgp單克隆抗體（Invitrogen公司出品），免疫組化樣品為DAB染色，以蘇木素對全部樣本的細胞核進行復染。使用Imagepro plus-6.0分析軟件分析Pgp顯色的強度，獲取單個組織區域面積的平均光度值。

將對照組與觀察組大鼠血樣進行生化分析并比較，將血樣以離心機離心取得上層血清，使用全自動型生化分析儀檢測血清中各項肝功能相關指標包括：谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、膽紅素（BIL）、總膽汁酸（TBA），脂質相關指標包括總三酰甘油（TG）、總膽固醇（Tch），肝組織勻漿中的Tch、TG及TBA水平。分析肝細胞脂肪病變的程度與Pgp表達水平的相關性。

1.3 統計學方法

研究相關數據均以手工輸入方式錄入至SPSS20.0軟件，一人錄入、一人復核。全部數據中的計量資料均采取獨立樣本均數t檢驗，相關性采取Spearman等級相關分析，等級資料采取Mann-Whitney U秩和檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組肝臟Pgp光度值與肝指數比較

對照組大鼠肝臟Pgp平均光度值為（1.01±0.13），肝指數為（1.69±0.68）%；觀察組大鼠肝臟Pgp平均光度值為（5.36±1.21），肝指數（3.35±0.37）%；觀察組肝臟Pgp平均光度值與肝指數均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.01）。見表1。

2.2 肝臟脂肪病變

觀察組肝臟脂肪病變+++的發生率為53.33%，對照組無+++級別肝臟脂肪病變發生，觀察組整體肝臟脂肪病變程度較對照組嚴重，差異有統計學意義（P<0.01）。見表2。

2.3 血清與肝勻漿生化指標及體質量

觀察組與對照組大鼠初始體質量、肝勻漿比較，差異無統計學意義（P>0.05）；觀察組與對照組大鼠血清Tch、肝勻漿TBA比較，差異有統計學意義（P<0.05）；兩組其他各項指標均可見統計學意義（P<0.01）。見表3。

2.4 相關性分析

經Spearman等級相關分析，肝臟脂肪病變程度與肝臟Pgp光度值呈顯著高度正相關性，r=0.996，0.8

3 討論

肝臟是人體脂肪代謝的一個主要器官[7-9]。肝細胞所合成的膽固醇于酯化作用后在27羥化酶與7α羥化酶的共同催化作用下生成膽汁酸，通過主動排泌到達膽管腔內，從而參與到膽汁形成的過程當中，這一過程是人體膽固醇清除的一項主要渠道。多數高脂血癥的患者可合并有明顯的肝內脂肪異常聚積[10-12]，對于肝臟功能可形成持續性損傷，并可進一步加重膽固醇代謝的紊亂[13-15]。Pgp糖蛋白以主動形式將肝細胞所合成的膽汁酸轉運入毛細膽管腔當中，促使其參與至肝細胞對于膽固醇的代謝過程。Pgp非選擇性的抑制類藥物能夠有效的控制膽固醇的酯化與合成，分析其主要機理為抑制劑將膽固醇由細胞膜至內質網的這一轉運過程完全或部分阻滯而形成的。細胞水平的相關研究表明Pgp的表達可致使細胞內的膽固醇總量升高。提示了Pgp的異常表達對于膽固醇的代謝紊亂形成與發展以及肝內脂肪發生沉積的過程發揮了促進作用。

本研究通過高脂飼料喂養的方法建立了膽固醇代謝紊亂的大鼠模型，建模后觀察組肝臟脂肪病變+++的發生率為53.33%，對照組無+++級別肝臟脂肪病變發生，觀察組整體肝臟脂肪病變程度較對照組嚴重，差異具有統計學意義（P<0.01），能夠滿足本次試驗的要求。對照組大鼠肝臟Pgp平均光度值為（1.01±0.13），肝指數為（1.69±0.68）%；觀察組大鼠肝臟Pgp平均光度值為（5.36±1.21），肝指數（3.35±0.37）%；通過對比得知觀察組顯著高于對照組。可見膽固醇代謝紊亂的大鼠當中Pgp蛋白出現過高表達，其肝臟脂肪的病變程度與肝臟Pgp呈顯著高度正相關，說明肝臟內脂肪積聚越嚴重肝臟Pgp蛋白的表達水平越高，揭示出Pgp蛋白在膽固醇于肝內積聚并逐漸形成代謝紊亂這一全過程中均發揮著重要的促進作用。同時通過對兩組大鼠的血清相關生化指標觀察發現，肝功能相關指標、脂質相關指標、肝組織勻漿中的Tch、TG及TBA水平均可見統計學意義（P<0.05）；同時通過4周高脂喂養及限制運動后，觀察組大鼠的體質量顯著高于對照組，肝指數也顯著高于對照組大鼠。通過比較兩組大鼠的肝臟脂肪病變程度我們能夠發現，觀察組大鼠的病變程度較對照組更為嚴重，提示在肝臟脂肪病變程度較高的大鼠中Pgp值、肝指數、Tch、TG及TBA水平均可見明顯異常改變。

綜上所述，膽固醇代謝紊亂SD大鼠的肝細胞膜生物泵糖蛋白較正常健康SD大鼠顯著升高，提示Pgp蛋白在膽固醇代謝紊亂的形成與演進過程中均發揮著重要的促進作用，這一研究結果希望能夠為臨床防治及相關藥物研究提供新的參考與思路。

[參考文獻]

[1] 董玲玲，郭荔，戴小華，等.P-糖蛋白在健康豬肝臟、腎臟和腸組織中的分布及其mRNA相對轉錄水平[J].畜牧獸醫學報，2013，44（9）：1454-1461.

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[2] ZHAO Rui-zhi，LIU Li-juan，WANG Yin-jie，et al. Vinegar-baked Radix Bupleuri modulates the cell membrane constituents and inhibits the P-gp activity in rat hepatocytes[J].Complementary and Alternative Medicine，2014，5（14）：357.

[3] 程志英，李霞，張淑珍，等.二甲雙胍對糖尿病大鼠肝臟中重要轉運蛋白表達的影響[J].中國藥師，2014，17（6）：901-903.

[4] 湯燕，高巧慧，吳臻，等.P-糖蛋白的細胞內轉運及表達調控[J].生命的化學，2014，34（1）：93-97.

[5] 杜惠惠，任強，劉曉民.P-糖蛋白介導的腫瘤多藥耐藥機制及其逆轉策略[J].中華肺部疾病雜志（電子版），2013，6（6）：551-553.

[6] 楊雯，周惠芬，楊潔紅，等.川芎嗪在Caco-2細胞單層模型的轉運特征及對P-糖蛋白表達的影響[J].中草藥，2013，44（5）：581-585.

[7] 薩礎拉，呂航，姜艷艷，等.三七皂苷在大鼠外翻腸囊中的吸收及與P-糖蛋白相互作用研究[J].北京中醫藥大學學報，2011，34（12）：836-842.

[8] 穆艷飛.IL-6對類風濕關節炎患者外周血淋巴細胞P-糖蛋白的調控研究[D].山西醫科大學，2014.

[9] Binkhathlan Z，Lavasanifar A.P-glycoprotein inhibition as a therapeutic approach for overcoming multidrug resistance in cancer：current status and future perspectives[J].Curr Cancer Drug Targets，2013，13（3）：326-346.

[10] 陳振興，趙瑞芝.醋柴胡不同部位對肝郁模型大鼠肝臟Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶活性及P-糖蛋白mRNA表達的影響[J].中華中醫藥雜志，2016，31（9）：3721-3724.

[11] Patel A，Tiwari AK，Chufan EE，et al.PD173074，a selective FGFR inhibitor，reverses ABCB1-mediated drug resistance in cancer cells[J].Cancer Chemother Pharmacol，2013，72（1）：189-199.

[12] 侯鵬高.動脈粥樣硬化與脂代謝紊亂研究進展[J].齊齊哈爾醫學院學報，2015，36（7）：1039-1040.

[13] 康卓穎，初欣欣，楊潤梅，等.金黃地鼠高脂血癥模型膽固醇代謝紊亂的生物標志物的研究[J].中國藥理學通報，2014，30（6）：880-883.

[14] 王鳳玲，隋小芳，索樹珍，等.膽固醇代謝紊亂及其相關疾病的研究進展[J].中國老年保健醫學，2015，13（1）：13-15.

[15] 李鳳霞，李金磊，榮向路，等.脂肪分化障礙引起的胰島素抵抗、脂肪肝及高膽固醇血癥小鼠模型研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2014，25（1）：96-101.

（收稿日期：2017-01-27）