RTCA實時監控SAHA對乳腺癌MCF-7細胞生長狀態的影響

周偉強

（沈陽醫學院基礎醫學院，遼寧省環境污染與微生態重點實驗室，遼寧沈陽110034）

RTCA實時監控SAHA對乳腺癌MCF-7細胞生長狀態的影響

周偉強

（沈陽醫學院基礎醫學院，遼寧省環境污染與微生態重點實驗室，遼寧沈陽110034）

目的：應用實時無標記動態細胞分析（RTCA）技術研究SAHA抑制乳腺癌MCF-7細胞生長的情況。方法：采用RTCA系統動態監測不同劑量（0、0.5、1、2、5、10、20、50μmol/L）SAHA對乳腺癌MCF-7細胞生長的影響。結果：5、10μmol/L的SAHA孵育48 h后可顯著抑制細胞的生長，為SAHA抑制MCF-7細胞生長的最佳實驗劑量和作用時長；而相關劑量的DMSO無抑制作用。結論：RTCA系統可準確地監測SAHA抑制乳腺癌MCF-7細胞生長的情況。

乳腺癌；MCF-7；SAHA；RTCA

xCELLigence RTCA（real-time cell analysis）是應用實時無標記動態細胞分析技術，實時、動態、定量跟蹤細胞的生長、遷移及浸潤的動力學檢測。該系統將微電子細胞傳感器芯片整合到特制16孔板內（E Plate-16）的微孔膜下層，從而實時并精確地監測細胞的各種變化［1-3］。

表觀遺傳學（Epigenetics）又稱“表遺傳學”、“后遺傳學”，是指在沒有細胞核DNA序列改變的情況時，基因功能發生的可逆、可遺傳的改變。這些改變包括DNA的修飾（如甲基化修飾）和組蛋白的各種修飾等［4-5］。近年研究發現，乳腺癌發生過程中，乳房腺上皮細胞在多種致癌因子作用下發生了表觀遺傳的改變而致使細胞增殖失控，其中乙酰化和去乙酰化起了很大的作用，而對于組蛋白乙酰化和去乙酰化調控是由一組蛋白酶完成的，分別為組蛋白乙酰化轉移酶（histone acetyltransferase，HAT）和組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）。

SAHA（Suberoylanilide Hydroxamic Acid）作為一種HDAC抑制劑，可抑制組蛋白去乙酰化過程，造成癌細胞轉錄過程異常，阻滯其細胞周期進程并誘導細胞凋亡的發生［6-7］。因此其在臨床上有非常良好的應用前景。因此，本文選取乳腺癌MCF-7細胞，利用RTCA技術研究SAHA抑制乳腺癌MCF-7細胞生長的情況。

1 材料與方法

1.1 材料RTCA實時細胞分析系統購自艾森生物（杭州）有限公司；人乳腺癌細胞株MCF-7由本實驗室凍存；RPMI-1640培養基、胎牛血清、青霉素以及鏈霉素購自美國Thermo公司；SAHA、DMSO及其它的化學試劑購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養人乳腺癌MCF-7細胞在含10%胎牛血清、100 U/ml的青霉素、100μg/ml的鏈霉素的RPMI-1640培養基中培養。

1.2.2 RTCA系統動態監測SAHA對乳腺癌MCF-7細胞生長的影響將1×104/ml乳腺癌MCF-7細胞接種于RTCA系統的E-Plate 16孔板中。無血清同步化處理后，各孔分別加入0、0.5、1、2、5、10、20、50μmol/L不同劑量的SAHA。并以相關劑量DMSO作為對照。設定監控時長為72 h，時間間隔為1 h進行實時觀察。隨著時間的推移，通過RTCA系統動力學變化反應曲線反映各孔0～72 h間MCF-7的細胞生長狀況。

2 結果

2.1 SAHA顯著抑制乳腺癌細胞的生長從T1時段（從將培養瓶中的MCF-7細胞消化后接種到RTCA系統的E Plate-16孔后繼續培養24 h）的各個細胞曲線來看，各孔的細胞生長良好，體現在細胞曲線隨著培養時間的延長，細胞曲線不斷上升，無明顯停滯和下降的情況發生。T2時段（無血清培養的細胞同步化階段）內細胞的培養液換成不含胎牛血清的培養液，其目的是抑制細胞周期的進程，而將RTCA各孔的細胞全部停留在G1期，以便下一步的細胞實驗。T2時段的同步化的細胞曲線都有不同程度的下降，而在同步化培養10 h后，細胞曲線趨于平行，細胞增殖受到了抑制，達到了同步化的實驗目的。

從總時段的41 h開始，細胞重新換上含胎牛血清培養液，并加入不同濃度的SAHA和DMSO與MCF-7細胞進行培養。當加入SAHA和DMSO開始的5 h時段內，細胞形態由于新培養液的加入發生了一定的變化，這直接體現在以細胞形態為主要采集目標的RTCA細胞曲線的變化上。各孔細胞曲線都發生了急劇的變化，細胞曲線發生大幅度上升。但隨著培養時間的延長，細胞狀態趨于平穩，細胞曲線反映了細胞真實的狀態。

從SAHA的藥效方面，小劑量SAHA對MCF-7細胞影響不大，0.5、1μmol/L SAHA在培養接近60 h后對MCF-7的抑制作用非常有限；而大劑量SAHA則明顯顯示出抑制細胞生長的特性，20、50 μmol/L SAHA在培養不到20 h就明顯抑制了細胞的生長；而中劑量（5、10μmol/L）SAHA則在培養30～40 h明顯顯現出抑制MCF-7細胞生長的效果。見圖1A。

2.2 實驗劑量的DMSO對乳腺癌MCF-7細胞的生長無抑制作用對于DMSO來說，無論小劑量還是大劑量的DMSO對MCF-7細胞的影響均不十分顯著。在各種實驗劑量DMSO的作用下，MCF-7細胞仍能隨著培養時間的延長而不斷生長，RTCA曲線表現為持續延長并在培養40 h后到達生長平臺期。但同時也可以看出，隨著培養時間的延長，細胞培養液的營養成分的不斷喪失，細胞在孵育65 h后開始出現死亡，表現在RTCA曲線下降。見圖1B。

3 討論

RTCA系統通過新穎的電子傳感芯片設計，可連續監測生物反應的全過程，并且其監測是無標記、無創傷型的數據獲取和分析平臺，這種高準確度、高精確度的定量衡量細胞生長方法，可最大限度地模仿細胞自然狀態下的生長發育情況，對于腫瘤藥敏實驗是十分適合的［8-9］。本實驗就是利用了RTCA系統實時觀察了SAHA對乳腺癌細胞系MCF-7生長狀態的影響。

SAHA具有誘導細胞凋亡、阻滯細胞周期和促進細胞分化的作用［6］，且具有抗腫瘤廣譜性，具有潛在的臨床應用前景［10-13］。本實驗發現高劑量SAHA（20、50μmol/L）對MCF-7細胞抑制作用明顯，可在孵育開始后即發揮明顯地抑制腫瘤生長的效果，沒有留給細胞一個生長與抑制并存的環境，其毒性作用過強，不利用其它細胞實驗的實施。而低劑量SAHA對MCF-7細胞基本沒有體現出抑制生長的作用。因此通過RTCA系統可以很直觀地篩查出中劑量SAHA，尤其是5、10μmol/LSAHA孵育48 h可顯著抑制細胞的生長，是SAHA抑制MCF-7細胞生長的最佳實驗劑量和作用時長。

本文通過RTCA實時觀察了不同劑量的SAHA對乳腺癌MCF-7細胞生長產生的作用效果，并非常直觀地篩查出SAHA作用MCF-7細胞的最佳實驗劑量和作用時長，對于傳統增殖實驗篩查有著不可比擬的技術優勢，是一個很好的替代手段。

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圖1 RTCA實時監控不同劑量SAHA和DMSO對乳腺癌MCF-7細胞生長的影響（μm為μmol/L）

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RTCAM onitorsthe Inhibitory Effecton Proliferation of BreastCancer MCF-7Cellsw ith SAHA Treatment

ZHOUWeiqiang
（Shenyang MedicalCollege，Key Laboratory of EnvironmentalPollution and M icroecology of Liaoning Province，Shenyang 110034，China）

Objective：To observe the inhibitory effect on proliferation of breast cancer MCF-7 cellswith SAHA treatment by real-time cell analysis（RTCA）system.Method：RTCA was used tomonitor the proliferation ofbreast cancerMCF-7 cells treated with different doses of SAHA（0，0.5，1，2，5，10，20，50μmol/L）.Results：With 5，10μmol/L dose for 48 h treatment，SAHA significantly inhibited the proliferation of MCF-7 cells，while no dose-dependent effect in the same doses for the DMSO.Conclusion：RTCA system accurately monitors the inhibitory effect on proliferation of breast cancer MCF-7 cells with SAHA treatment.

breastcancer；MCF-7；SAHA；RTCA

R394.3

A

1008-2344（2017）03-0193-03

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.03.002

2017-03-06

（文敏編輯）

國家自然科學基金項目（No.81172509）

周偉強（1970—），男（漢），教授.研究方向：乳腺癌發生與調控.E-mail：zhouwq@hotmail.com