六神丸含服對炎性和神經病理性疼痛的治療作用

陶珊珊++李玉桑

摘要：為探究六神丸含服對炎性和神經病理性疼痛的治療作用，將90只昆明小鼠，按時間點（1/3 h， 1 h， 6 h）隨機分成3組每組分別設模型組、嗎啡治療組（10 mg/kg/d，腹腔注射）、雙氯酚酸鈉治療組（15 mg/kg/d；灌胃）、六神丸低高劑量組（2.812 mg/kg/d、14.06 mg/kg/d；含服），于給藥1/3 h、1 h、6 h后腹腔注射0.6%醋酸溶液，觀察了各組小鼠30 min內的扭體次數.另將15只雄性SD大鼠，給予紫杉醇（8 mg/kg/3d）建立神經病理性疼痛模型并隨機均分為模型組、六神丸治療組，分別在0、2、4、6、12 d后檢測了1.875 mg/kg/d六神丸治療后大鼠的熱、冷和機械痛閾值和肝組織H&E染色。結果表明：2.812 mg/kg/d的六神丸能抑制醋酸引起的炎性疼痛，在體內的作用時間持久；1.875 mg/kg/d六神丸含服給藥能明顯降低紫杉醇導致大鼠的熱、冷和機械痛閾值，明顯改善紫杉醇導致的大鼠肝臟損傷，減少肝臟炎癥。因此少量的六神丸含服有助于緩解炎性疼痛和神經病理性疼痛。

關鍵詞：鎮痛；六神丸；神經性病理性疼痛

中圖分類號：R285.5

文獻標識碼：A 文章編號：16749944（2017）10021104

1 引言

六神丸是由牛黃、蟾酥、雄黃、麝香、珍珠和冰片六味中藥配制而成的百年傳承神藥。其具有清熱解毒、消腫止痛和斂瘡生肌之功效，主要用于爛喉丹痧，喉風乳蛾，咽喉腫癰及癰疽疔瘡等癥[1]。研究發現灌服大于50 mg/kg的六神丸對二甲苯致小鼠耳廓腫脹有抑制作用，能減輕甲醛致大鼠足跖腫脹；減少醋酸所致小鼠扭體次數，延長扭體潛伏期[2]，對炎性疼痛有很好的治療作用。藥理研究實驗室在前期研究中發現低劑量（10 μg/ml）的六神丸有較好的抗癌活性[3]，能有效抑制癌細胞的生存。因此，在綜合了大量文獻和實驗室前期的研究基礎上，采用含服給藥方式，降低了六神丸的給藥劑量，研究了不同給藥時間對醋酸引起的炎性疼痛和化療藥物導致的神經病理性疼痛的改善效果，為其臨床抗癌鎮痛的應用提供科學依據。

2 實驗部分

2.1 試劑與儀器

六神丸（上海雷允上公司），雙氯芬酸鈉、伊紅、冰醋酸（Sigma），鹽酸嗎啡注射液（批號H21022436，東北制藥集團沈陽第一制藥廠），紫杉醇注射液（批號H10980170，海口市制藥廠有限公司），蘇木精（南京建成）；。足底測痛儀（美國Ugo Basile），手持式測痛儀（北京碩林苑科技有限公司），鐵架臺。

SPF級昆明小鼠由湖北省實驗動物研究中心提供，體重20～25 g，雄性；SPF級SD大鼠由湖北省實驗動物研究中心提供，體重200～250 g，雄性，許可證號SCXK（鄂）2008-0005。

2.2 方法

2.2.1 動物分組

動物的飼養環境為溫度22～25℃，濕度30%～40%。小鼠適應性飼養5d后，將90只小鼠按時間點隨機分成3大組，每組30只：①1/3 h組；②1 h組；③6 h組；每大組再均分成5個小組，每組6只：①模型組；②嗎啡治療組；③雙氯芬酸鈉治療組；④六神丸低劑量治療組；⑤六神丸高劑量治療組。大鼠適應性飼養5d后，將15只大鼠隨機分成3組，每組5只：①對照組；②模型組；③六神丸治療組。所有動物實驗和處理均遵照“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals：實驗動物的護理和使用指南”[4]。

2.2.2 動物模型的建立

（1）扭體模型的建立：小鼠進行醋酸致扭體模型的建立，給藥后1/3 h、1 h、6 h，動物逐一腹腔注射0.6%醋酸10 mL/kg，觀察并記錄各組小鼠30 min內的扭體次數。

（2）神經性病理性疼痛的建立：造模開始前分別檢測各組大鼠的熱痛閾值、機械痛閾值和冷痛閾值，各組大鼠（對照組注射等劑量的生理鹽水）注射8 mg/（kg·3d）紫杉醇溶液，誘導神經性病理性疼痛[5]。六神丸治療組經口含服（將藥物放入口腔中，待其在口腔中完全吸收后再放入籠中，并禁食禁水5 h）給予六神丸1.875 mg/（kg·d），其余各組不進行治療。在造模后2、4、6、12 d檢測各組大鼠足趾熱痛閾值、冷痛閾值和機械痛閾值。12 d后取各組大鼠的肝臟進行HE染色；

2.2.3 六神丸醇提上清的制備

取六神丸顆粒240粒，置于研缽研成細粉末。將粉末全部轉移至50 mL離心管中，加入42 mL無水乙醇進行溶解，放置1 d后得到醇提上清。將醇提上清凍干，保存于干燥器中備用，用時用麻油進行溶解。

2.2.4 醋酸小鼠扭體測試方法

陽性對照組灌胃給予15 mg/kg/d的雙氯酚酸鈉和腹腔注射10 mg/kg嗎啡，六神丸低、高劑量治療組分別含服給予2.812 mg/（kg·d）、14.06 mg/（kg·d）六神丸，模型組不給藥。分別在給藥1/3 h、1 h和6 h后，每只小鼠腹腔注射0.6%醋酸10 mL/kg，觀察并記錄各組小鼠30 min內的扭體次數[9]。抑制率=（對照組平均扭體次數-給藥組平均扭體次數）/對照組平均扭體次數× 100%。

2.2.5 熱痛閾值的測定

將大鼠置于足底測痛儀相應的格子里，待其安靜后，將紅外輻射燈移至其足底，開啟紅外輻射燈，當大鼠感覺到疼痛收縮爪子，此時紅外輻射燈熄滅，記錄計時器上所顯示的時間即為大鼠足底熱痛閾值。每只大鼠重復3次，每次至少間隔5 min，取3次實驗結果的平均值[6]。

2.2.6 機械痛閾值的測定

用手持式機械測痛儀測量大鼠的機械痛閾值。大鼠固定后，用測痛儀前端的針刺大鼠足底，刺到一定的力度后大鼠縮足，記錄此時在測痛儀上顯示的值，即為大鼠的機械痛閾值。每只大鼠重復3次，每次至少間隔5 min，取3次實驗結果的平均值[7]。

2.2.7 冷痛閾值的測定

采用冷板法測量大鼠的冷痛閾值。將大鼠置于（4±0.5）℃的冷板上，觀察并記錄大鼠從放上至縮足的時間，即為大鼠的冷痛閾值[8]。

2.2.8 大鼠肝臟H&E染色

大鼠脫頸椎處死后，取其肝臟的最大葉和次大葉置于福爾馬林溶液中固定，進行石蠟包埋。切片后進行H&E染色，光鏡下觀察肝臟病理學變化，并進行肝臟炎性評分[10]。

2.3 統計學處理

數據采用GraphPad Prism 5.0.1科學統計繪圖軟件分析，數據以x±s表示，組間和組內比較均采用雙因素方差分析（Two-way ANOVA），以p< 0.05為差異有統計學意義。

3 結果與討論

3.1 六神丸抑制醋酸引起的炎性疼痛

六神丸抑制醋酸引起的炎性疼痛結果見圖1。如圖1所示，陽性組灌服雙氯酚酸鈉或腹腔注射嗎啡1/3 h后，均可見小鼠的扭體次數明顯減少，雙氯芬酸鈉組為（84±6）次，嗎啡組為（21±3）次；與模型組進行雙氯酚酸鈉組（p<0.001）和嗎啡組（p<0.001）扭體次數顯著降低。低或高劑量的六神丸含服給藥也減少了小鼠扭體次數，低劑量六神丸組為（66±6）次，高劑量六神丸組為（69±5）次，低劑量六神丸的扭體抑制率為21.6%。給藥1 h后，低劑量的六神丸顯現出較有效的鎮痛效果（p<0.05）隨著給藥6 h后，嗎啡和雙氯酚酸鈉的治療效果減弱，嗎啡組為（72±17）次，雙氯芬酸鈉組為（44±11）次，而低、高劑量六神丸組的效果逐漸增強，低劑量六神丸組的小鼠扭體次數較模型組減少最為明顯（p<0.01），為（27±6）次，其扭體抑制率為35.2%。說明六神丸在體內作用時間較持久，低劑量的六神丸含服給藥疼痛具有明顯的改善作用。

3.2 六神丸抑制紫杉醇引起的神經病理性疼痛

六神丸對紫杉醇引起的神經病理性疼痛的抑制作用結果見圖2。腹腔注射紫杉醇造模第2 d后，與空白對照組（熱痛：29.0±1.3 s；機械痛：121.3%±16.3%；冷痛：27.8 s±10.8 s）相比，模型組大鼠的足底熱痛閾值（11.5 s±1.8 s， p<0.001）、機械痛閾值（68.2%±19.4%， p<0.05）降低最為明顯，有顯著性的差異；同時六神丸治療組，大鼠的足底熱痛閾值（17.4 s±1.8 s，p< 0.01）明顯下降。在腹腔注射紫杉醇造模第12天后，與空白對照組相比，模型組的熱痛閾值仍然相對較低（熱痛：19.3 s±1.7 s，p< 0.05），六神丸治療對大鼠的熱痛閾值（22.1 s±2.6 s）、機械痛閾值（102.5%±5.2%）以及冷痛閾值（19.2 s±6.1 s）與空白對照組相近，改善作用明顯。這說明六神丸含服給藥亦能夠有效改善化療紫杉醇引起的神經病理性疼痛反應。如圖2所示，腹腔注射紫杉醇造模第2 d后，與空白對照組（熱痛：29.0±1.3 s；機械痛：121.3%±16.3%；冷痛：27.8 s±10.8 s）相比，模型組大鼠的足底熱痛閾值（11.5 s±1.8 s）、機械痛閾值（68.2%±19.4%）以及冷痛閾值（10.6 s±1.4 s）均下降到最低；而六神丸治療后，大鼠的足底熱痛閾值（17.4 s±1.8 s）、機械痛閾值（74.3%±5.6%）和冷痛閾值（12.6 s±2.2 s）均有不同程度恢復.在腹腔注射紫杉醇造模第12天后，相對于模型組（熱痛：19.3 s±1.7 s；機械痛：73.3%±9.5%；冷痛：15.0 s±1.3 s），六神丸治療對大鼠的熱痛閾值（22.1 s±2.6 s）、機械痛閾值（102.5%±5.2%）以及冷痛閾值（19.2 s±6.1 s）改善更為明顯。這說明六神丸含服給藥亦能夠有效改善化療紫杉醇引起的神經病理性疼痛反應。

3.3 六神丸緩解紫杉醇引起的肝損傷

將大鼠的肝組織石蠟包埋后進行切片，行H&E染色，染色結果如圖3所示，圖3a中大鼠的肝臟組織結構完整，無明顯的肝炎癥；而在模型組肝臟中，圖3b中可見明顯的炎癥，在血管周圍有大量的炎癥浸潤，且肝細胞結構不完整；圖3c中在血管周圍的炎性細胞減少，肝細胞結構相對完整。說明六神丸能夠明顯的降低肝臟炎癥的產生。

各組大鼠的肝組織的炎癥評分，即在20倍視野下數炎性灶的個數：0個計0分；1個計1分；2～4個計2分；4個以上計3分，結果見圖4。如圖4所示，六神丸含服給藥能夠有效地減少肝臟損傷，緩解化療藥物所引起的炎癥（對照組：0.75±0.25；紫杉醇組：2.67±0.33；六神丸治療組：1.33±0.33），說明六神丸治療后大鼠的肝組織炎癥得到緩解，炎癥浸潤有明顯改善。

4 結論

冰片、雄黃、珍珠六味中藥，具有清熱解毒、消腫散結的功效，能治療流行性感冒、急性腮腺炎和冠心病心絞痛等各類炎癥疼痛相關疾病[11]。

該實驗采用化學刺激造模，腹腔注入醋酸引起前列腺素的釋放，誘導產生炎性疼痛，評價六神丸外周鎮痛藥的效果。馬宏躍等[12]灌胃給予六神丸大劑量112 mg/kg，15 min、45 min、1 h后腹腔注射醋酸觀察小鼠的扭體抑制率為27.6%， 1 h后藥物作用基本減弱至消失，六神丸中抗炎鎮痛的主藥是蟾酥和牛黃。該實驗中小鼠含服給予六神丸2.812，14.06 mg/kg，給藥20 min、1 h、6 h后腹腔注射醋酸，低劑量20 min、6 h后的扭體抑制率分別為21.6%和35.2%，鎮痛時間更長，劑量更低其六神丸的鎮痛主要成分是華蟾毒素[13]。且采取含服給藥的方式，避免了肝首過效應，在大大降低給藥劑量的同時，獲得更好的鎮痛效果和延時鎮痛的優勢。而低劑量的六神丸在體內的作用時間較雙氯酚酸鈉和嗎啡更持久，說明六神丸能有效抑制炎性疼痛，比傳統的高劑量多次給藥的效果好，為進一步研究抗炎鎮痛的活性成分提供了依據。

化療后疼痛是癌癥患者最常發生的后遺癥之一，其重要原因是其誘發的外周神經性疾病，臨床上常用化療藥如長春堿類、紫杉堿類等均可誘發周圍神經病變，發生率從30%～100%[14]，這類疼痛屬于神經病理性疼痛的范疇。目前臨床上對于這類疼痛的治療鮮有確切有效的方法。臨床研究表明：六神丸配合三階梯止痛法能治療癌性疼痛[15]，給予病人一次10粒，每日3次的劑量。在本實驗中對大鼠給予六神丸含服一次1粒、每日1次（相當于成人的劑量），發現六神丸能有效的抑制紫杉醇導致的神經病理性疼痛，為進一步研究六神丸治療癌痛機制提供了依據。苗萬等[16]總結六神丸能降低毛細血管通透性，減少炎癥滲出，減輕竇道口的充血及腫脹，使巨噬細胞激活，增強其吞噬能力，直接抑制細菌生長并殺傷細胞，產生抗炎、消腫止痛的作用。實驗發現六神丸能明顯改善肝臟炎癥，減少化療藥物引起的肝損傷，說明少量的六神丸可有效緩解神經病理性疼痛，降低化療藥物對肝組織的損傷。

可見少量的六神丸含服給藥具有較好抗炎鎮痛的作用，能夠同時緩解神經病理性疼痛和炎性疼痛，有助于臨床化療藥物的配合使用，其詳細鎮痛的機制仍有待進一步的研究。

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