補(bǔ)體的制備及其經(jīng)典激活途徑在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用

滕麗娟

廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院 廣西壯族自治區(qū)南寧市 530222

補(bǔ)體的制備及其經(jīng)典激活途徑在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用

滕麗娟

廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院 廣西壯族自治區(qū)南寧市 530222

目的：探討如何制備新鮮豚鼠血清作為補(bǔ)體的方法及補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用。方法：對(duì)豚鼠進(jìn)行心臟采血，血液放放置37℃水浴箱30min析出血清，收集帶有少量紅細(xì)胞的血清離心，取上清液從而獲得含有大量補(bǔ)體的豚鼠血清。顆?？乖?%綿陽(yáng)紅細(xì)胞）與相應(yīng)抗體(溶血素）特異結(jié)合產(chǎn)生的免疫復(fù)合物可激活補(bǔ)體的經(jīng)典途徑從而使綿羊紅細(xì)胞細(xì)胞溶解。綿羊紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了補(bǔ)體被激活后產(chǎn)生的溶血作用。結(jié)果：同時(shí)具備有抗原，相應(yīng)抗體，補(bǔ)體的試管發(fā)生綿羊紅細(xì)胞溶血現(xiàn)象。結(jié)果顯示陽(yáng)性。結(jié)論：豚鼠血清做補(bǔ)體的制作方法簡(jiǎn)單，快速。血清含補(bǔ)體成分高，補(bǔ)體活性強(qiáng)。用于實(shí)驗(yàn)制作成本低，實(shí)驗(yàn)效果顯著，可大量使用于相關(guān)高校的免疫學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

補(bǔ)體；血清制備；溶血實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)教學(xué)

補(bǔ)體（complement,C)系統(tǒng)是廣泛存在于人和脊椎動(dòng)物新鮮血清、組織液和細(xì)胞膜表面具有多種調(diào)控機(jī)制的蛋白酶促反應(yīng)系統(tǒng)，由30余種可溶性蛋白和膜結(jié)合蛋白組成，激活后具有多種生物功能。生理情況下，血清中的補(bǔ)體成分多以無活性的酶前體形式存在。只有當(dāng)激活物存在時(shí)，補(bǔ)體各成分才可依次被激活形成一系列級(jí)酶促反應(yīng)，最終出現(xiàn)溶細(xì)胞等效應(yīng)。目前研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體激活的主要途徑有：經(jīng)典途徑，凝集素途徑和旁路途徑。本文通過對(duì)豚鼠進(jìn)行心臟采血，離心血液取血清作為補(bǔ)體，應(yīng)用補(bǔ)體激活的經(jīng)典途徑方式驗(yàn)證補(bǔ)體激活后的溶血作用。實(shí)驗(yàn)包括實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇，動(dòng)物如何抽血，血清分離和溶血實(shí)驗(yàn)操作等進(jìn)行探討。

1 主要試劑與器材

1.1 抗原，抗體，補(bǔ)體

2%綿羊紅細(xì)胞(2%SRBC)、溶血素、豚鼠血清（自制）。

1.2 試劑與器材

生理鹽水、試管、離心機(jī)、試管架、注射器、無菌培養(yǎng)皿、吸管等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 補(bǔ)體的制備

2.1.1 動(dòng)物的選擇

研究發(fā)現(xiàn)豚鼠血清補(bǔ)體含量都高于其他動(dòng)物，而且豚鼠體型較小，性格溫順比較容易控制。因此本實(shí)驗(yàn)選擇豚鼠做為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

2.1.2 心臟采血

需兩人協(xié)作，一人將豚鼠固定仰臥。采血者用左手在胸骨左側(cè)觸摸到心臟跳動(dòng)最快，最有節(jié)湊的地方。確定好部位后用碘伏消毒，用針頭刺入心臟。泵血后應(yīng)迅速取血，以防豚鼠掙扎針頭脫落。如果針頭已刺入心臟還沒有泵血出來時(shí)，可將針頭慢慢退出一點(diǎn)即可。失敗時(shí)應(yīng)拔出重新操作，切記針頭在胸腔內(nèi)擺動(dòng)，以防損傷心臟和肺致動(dòng)物死亡。一般一只豚鼠可采血10ml。

2.1.3 分離血清

采到的血液不能抗凝，置于無菌75mm培養(yǎng)皿中蓋好。室溫靜置或置于37℃環(huán)境中促凝。待析出血清后收集血清放入離心管進(jìn)行離心（一般離心3000r/ min,15min)，收集上清液。所得到上清液即為含有大量補(bǔ)體的血清。

2.2 溶血實(shí)驗(yàn)檢測(cè)補(bǔ)體激活的生物作用

此實(shí)驗(yàn)是醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)學(xué)科必須掌握的基礎(chǔ)技能之一，是臨床上測(cè)定人體血清總補(bǔ)體活性，了解機(jī)體的免疫水平的一個(gè)驗(yàn)證方法。闡明了某些疾病的發(fā)病機(jī)理，并作為有關(guān)疾病的診斷和觀察病情變化的一項(xiàng)重要指標(biāo)。作為醫(yī)學(xué)生掌握這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)是非常有必要的。我們實(shí)驗(yàn)使用的顆粒抗原是新鮮2%綿羊紅細(xì)胞，抗體溶血素做1:50稀釋，新鮮豚鼠血清做補(bǔ)體按1:15稀釋，生理鹽水做平衡對(duì)照。按照表1的要求添加試劑。

表1

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)是利用對(duì)比，排除的驗(yàn)證方法。發(fā)現(xiàn)只有同時(shí)存有綿陽(yáng)紅細(xì)胞，抗綿羊紅細(xì)胞抗體（溶血素），補(bǔ)體的情況下才出現(xiàn)紅細(xì)胞溶解現(xiàn)象。驗(yàn)證了只有抗原（綿羊紅細(xì)胞）與相應(yīng)抗體（溶血素）特異結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物（免疫復(fù)合物），才能激活補(bǔ)體的經(jīng)典途徑而使綿羊紅細(xì)胞溶解，發(fā)生溶血現(xiàn)象。即只有第一管發(fā)生溶血，結(jié)果顯陽(yáng)性。其它管均不符合激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑的條件而無法發(fā)生溶血。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)為綜合性實(shí)驗(yàn)，涉及學(xué)生要自己選擇動(dòng)物，自己抽血取血清，自己通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果。實(shí)驗(yàn)中使用到一些簡(jiǎn)單又常用的儀器設(shè)備，充分體現(xiàn)了學(xué)生的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)操作的綜合能力。有利于培養(yǎng)學(xué)生動(dòng)手能力，思考能力。另外，豚鼠血清做補(bǔ)體的制作方法簡(jiǎn)單，快速。血清含補(bǔ)體成分高，補(bǔ)體活性強(qiáng)用于實(shí)驗(yàn)制作成本低，實(shí)驗(yàn)效果顯著，可大量使用于相關(guān)高校的免疫學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

[1]郭立軍,王晶,甚元英,等.三種免疫血清制備方法的比較[J].大理學(xué)院學(xué)報(bào),2004,3(05):7-8.

[2]梁瑩.山羊紅細(xì)胞在補(bǔ)體溶血試驗(yàn)中的應(yīng)用[J].咸寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1996,10(03)140.

滕麗娟（1983-），女，壯族，廣西壯族自治區(qū)南寧市人。大學(xué)本科學(xué)歷。助教職稱。主要研究《微生物與免疫學(xué)》的實(shí)驗(yàn)教學(xué)與實(shí)驗(yàn)方法改進(jìn)的方向，特別是醫(yī)學(xué)類三本院校的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革和實(shí)驗(yàn)改進(jìn)工作，尋求出更適合醫(yī)學(xué)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)教學(xué)方案。