免疫分析技術在獸藥殘留檢測中的有效利用

拜錦美+洪加平+成強+陳京都+吳紅軍

摘要：以膠體金免疫層析法為研究方法，研究免疫分析技術在獸藥殘留檢測中的應用效果。建立一種用于快速檢測動物制品中磺胺類藥物的膠體金免疫層析法，檢測動物制品中磺胺類藥物殘留。膠體金采用檸檬酸三鈉還原法制備顆粒直徑為20 mm的膠體金纖維素膜，對待測樣品中的磺胺類藥物羽包被抗原中競爭集合膠體金標記抗磺胺類藥物多克隆抗體相結合，用肉眼觀察檢測線顏色深淺變化。采用該種檢測手段，對豬肉、肌肉和魚類樣品進行簡單提取和稀釋之后，就能夠直接開始檢測。視覺檢測限度為0.01 mg/kg，檢測時間在10 min以內，操作簡便，靈敏性較高。膠體金免疫層析法具有較高的靈敏性和特異性，整個操作過程簡單，容易操作，檢測結穩定，可以作為磺胺類藥物現場檢查使用，在今后的動物獸藥殘留檢測中值得推廣應用。

關鍵詞：膠體金層析法；獸藥殘留；應用

拜錦美，洪加平，成 強，等. 免疫分析技術在獸藥殘留檢測中的有效利用[J]. 農業工程技術，2017，37（08）：14+17

進入新世紀以來，畜牧產業不斷向前發展，獸藥在畜牧產業中的應用范圍和應用頻率在逐年增加，其在防控多種疾病，促進畜禽動物健康生長、提高飼料利用率和改善畜禽產品質量以及品質方面發揮著十分重要的作用，逐漸成為未來現代化畜牧產業發展不可或缺的生產資料。

但是畜牧行業在使用獸藥過程中還存在很多問題，大劑量、多種類的過度使用，導致了動物體內的藥物積累量不斷提升，在整個動物養殖周期內，動物很難全部將其代謝出去。消費者在購買了藥物殘留的畜禽產品之后，將過量的藥物引入人的體內，最終導致人藥物蓄積，給肝腎造成嚴重負擔。

現階段，動物制品藥物殘留已經成為制約畜牧產業可持續發展的關鍵性因素。為了解決獸藥殘留問題，本次研究過程中建立了一種用于快速檢測獸藥殘留的膠體金層析檢測法。

1 試驗方法和試驗材料

1.1 試驗材料和儀器

試驗材料：氯金酸、磺胺異噁唑、磺胺噻唑、磺胺氯噠嗪、磺胺甲二唑、聚乙二醇、牛血清白蛋白、羊抗兔IgG、抗磺胺類多克隆抗體、磺胺類半抗原[1]。

儀器：硝酸纖維素膜、蛋白純化儀、紫外/可見分光光度計、樣品墊、膠體金結合墊、吸水墊、PVC 襯板、劃膜儀、切條機[2]。

購于市場的豬肉、雞肉和鯽魚，液相儀器檢測為不含磺胺類藥物的陰性樣品。

1.2 膠體金免疫層析試紙條制備

首先，采用免疫親和層析法對磺胺類藥物多克隆抗體進行純化；其次，膠體金制備[3]。將100 mL0.01%的氯金酸用恒溫電磁攪拌器加熱到沸騰，加熱攪拌的同時向其中添加2 mL1%的檸檬酸三鈉，當溶液變為無色繼續攪拌8 min，冷卻到室溫環境下，向其中加入雙蒸水回復到原來體積，在4℃的冰箱中保溫。

膠體金1 mL，用0.2 mol/L的碳酸鉀溶液調節膠體pH值到9.0，一邊攪拌一邊加入抗磺胺類多克隆抗體28 ?g，充分攪拌2 min后靜置50 min，再向其中添加10 mL濃度為20%的聚乙二醇和20 ?L濃度為20%牛血清蛋白溶液，充分攪拌1 min，4℃離心3 min處理，將上層100 ?L清夜去除，然后保存。

配制金標抗體稀釋液。100 mL雙蒸水加入12 g的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，1 mLTween-20，1 g的牛血清蛋白和0.5 mL的聚乙二醇以及0.5 mL含量為10%的疊氮鈉溶液。

膠體金免疫層析條制備[4]。將包被好的磷酸鹽緩沖溶液稀釋為原來濃度的1、2、4、6、8倍，將劃膜儀器的參數設定為0.6、0.8、1.0、1.2 ?L/cm，劃膜干燥后使用金標抗體按照1：4、1：8、1：10、1：12、1：15的比例稀釋，觀察試紙條控制線和檢測線的長度以及顏色變化情況；最后，準確稱量豬肉、雞肉和魚肉2 g，切碎后放入試劑瓶中加入0.5 mL和1.5 mL的甲醇和PBST溶液，均勻攪拌后過濾，得到的濾液用磷酸鹽緩沖溶液稀釋10倍[5]。

2 結果分析

2.1 膠體金測試條靈敏度分析

將待測樣品滴入樣品墊上，由于毛細管作用，樣品中的磺胺類藥物和固定在顯色中的包被抗原競爭結合膠體金標記的抗體相結合，磺胺類藥物的含量越高，與抗體結合的越少，從而使得檢測線的周圍和空白對照區域顏色較淺。檢測線所固定的包被抗原所結合的金標抗體少于一定數量的話，檢測線顏色就會消失，而質控線會始終顯示紅色。通過對8種磺胺類藥物進行測試發現，前五種的檢測靈敏度較高，所以本次研究過程中選擇使用磺胺異噁唑、磺胺噻唑、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺氯噠嗪作為研究藥物。詳細情況見表1所示。

2.2 豬肉、雞肉和魚肉樣品檢測結果分析

將上述五種磺胺類藥物分別添加到上述豬肉、雞肉和魚肉樣品中，最終濃度為0、0.01、0.05、0.1 mg/kg[6]，并按照上述測試方法對樣品濾液進行處理，得到了如圖1所示。通過對圖1進行分析發現，磺胺異噁唑、磺胺噻唑、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺氯噠嗪五種磺胺類藥物在豬肉、雞肉和魚肉中視覺檢測標準為0.01 mg/kg。同時對氯霉素、萊克多巴胺、鹽酸克倫特羅、恩諾沙星的檢測結果顯示，上述物質濃度在1000 mg/mL時不存在交叉反應，本次試驗制備的試紙條對磺胺類藥物有較強的特異性。

3 討論

膠體金層析法在應用過程中，膠體金的制備十分關鍵，膠金粒的大小是否均勻一致是判斷膠體金穩定性的主要指標，如果膠體金顆粒直徑變異范圍過大，就會顯著影響到試驗的穩定性和重復性，如果顆粒形狀不規則，蛋白固定不緊固，會嚴重影響到檢測結果[7]。

本次研究過程，在某農貿市場和超級市場中隨機采集雞肉樣品250份，用膠體金層析法進行檢測，檢測出11份雞肉中含有磺胺類藥物，其中8份雞肉中磺胺類藥物的濃度高達10-100 mg/g，有3份雞肉磺胺類藥物的濃度高達100 mg/g以上，效果比較顯著。

本次試驗過程中建立的膠體金層析法對五種磺胺類藥物的殘留進行了檢測，并且磺胺異噁唑、磺胺噻唑、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺氯噠嗪五種磺胺類藥物殘留檢測和氯霉素、萊克多巴胺、鹽酸克倫特羅、恩諾沙星之間不存在交叉反應。在進行雞肉、豬肉和魚肉等制品藥物殘留檢測過程中，方便快捷，視覺檢測標準為為0.01 mg/kg，并且制備的試紙保存時間較久，操作容易，直接通過目測診斷，相信在今后的獸藥殘留檢測會有更好的應用。

參考文獻

[1] 郭 浩，王燕飛，鄒明強，等. 農獸藥多殘留檢測方法的研究進展[J]. 中國畜牧獸醫，2012（01）.

[2] 王玉金，胡宜亮，楊書豪，等. 氯霉素殘留膠體金免疫層析快速檢測法的研制[J]. 河南科學，2011（12）.

[3] 蔣 蔚，劉迎春，陳永軍，等. 萊克多巴胺膠體金免疫層析法快速檢測試紙條的研制[J]. 中國動物傳染病學報，2011（06）.

[4] 李超輝，陳雪嵐，郭 亮，等. 膠體金免疫層析法定量檢測豬肉中克倫特羅[J]. 食品與發酵工業，2013（04）.

[5] 柳愛春，劉 超，趙 蕓，等. 免疫膠體金法快速檢測水產品中硝基呋喃類代謝物的研究[J]. 浙江農業學報，2013（01）.

[6] 姜金慶，楊雪峰，王自良，等. 克倫特羅和萊克多巴胺多殘留膠體金免疫層析試紙條的研制[J]. 畜牧獸醫學報，2013（01）.

[7] 趙正苗，羅曉琴，汪善良，等. 應用膠體金免疫層析法檢測動物組織中呋喃西林代謝物的殘留[J]. 上海畜牧獸醫通訊，2012（05）.