虎杖苷通過(guò)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡的初步研究

潘紀(jì)紅+王海濱+杜曉飛+劉江月+張代娟

[摘要] 通過(guò)觀察虎杖苷對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞體外生長(zhǎng)的抑制作用，初步探討其誘導(dǎo)凋亡的可能機(jī)制。不同濃度的虎杖苷（50，100，150 μmol·L^-1）處理HeLa細(xì)胞后，采用MTT法檢測(cè)虎杖苷對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用，AO/EB染色法熒光顯微鏡觀察HeLa細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化；Annexin/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)HeLa細(xì)胞凋亡率；流式細(xì)胞儀分析HeLa細(xì)胞周期分布；RT-PCR和Western blot法檢測(cè)HeLa細(xì)胞中PI3K，AKT，mTOR，P70S6K的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，虎杖苷顯著抑制HeLa細(xì)胞增殖，且具有一定劑量依賴性；虎杖苷能夠引起HeLa細(xì)胞發(fā)生S期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，顯著下調(diào)HeLa細(xì)胞中PI3K，AKT，mTOR，P70S6K的mRNA和蛋白表達(dá)。表明虎杖苷具有抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用，其機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路及其下游基因蛋白表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 虎杖苷； 宮頸癌； HeLa細(xì)胞； PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路； 凋亡

[Abstract] To observe the effect of polydatin on proliferation and apoptosis of cervical cancer HeLa cells and explore its possible mechanism. The growth inhibitory effect was detected with MTT assay. After HeLa cells were treated with different concentrations （50， 100， 150 μmol·L^-1） of polydatin， MTT assay was used to detect the inhibitory effect of polydatin on proliferation of HeLa cells； Acridine orange/ethidium bromide staining was used for morphological changes in apoptotic HeLa cells； Annexin/propidium iodide staining was applied to detect HeLa cell apoptotic rate. In addition， flow cytometry was employed to analyze apoptosis and cell cycle distribution； RT-PCR and Western blot assay were used to detect PI3K， AKT， mTOR， and P70S6K mRNA and protein expression levels. The results showed that polydatin significantly inhibited HeLa cells proliferation in a dose-dependent manner. Polydatin can cause S phase arrest for HeLa cells， promote cell apoptosis and decrease the mRNA and protein expression levels of PI3K， AKT， mTOR and P70S6K. It indicated that polydatin could inhibit proliferation and induce apoptosis of cervical cancer HeLa cells， and the mechanism may be associated with inhibiting the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway and suppressing downstream gene expression.

[Key words] polydatin； cervical cancer； HeLa cell； PI3K/AKT/mTOR signaling pathway； apoptosis

宮頸癌是我國(guó)婦科最常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅廣大婦女的生命健康。近年來(lái)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，且發(fā)病年齡不斷年輕化。近年來(lái)對(duì)化療在宮頸癌治療中的應(yīng)用進(jìn)行了大量的研究，并取得了良好的效果[1]。常用的順鉑、五氟尿嘧啶等化療藥物費(fèi)用昂貴，且毒性作用嚴(yán)重。因此，尋找高效低毒的化療藥物至關(guān)重要。目前，從傳統(tǒng)中藥等植物提取物中尋找毒性低、療效高的抗癌活性成分并探討其作用機(jī)制，已成為當(dāng)今腫瘤治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。虎杖苷是從虎杖的干燥根莖中提取的單體，以往研究表明其在抗炎[2]、抗過(guò)敏[3]、改善微循環(huán)[4]等方面有顯著作用，近年來(lái)有研究報(bào)道虎杖苷具有抗腫瘤作用，可以抑制鼻咽癌、肺癌、結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、分化[5-7]。然而其對(duì)宮頸癌細(xì)胞是否具有抑制作用，國(guó)內(nèi)外未見相關(guān)報(bào)道。Rashmi和Husseinzadeh等[8-9]研究證實(shí)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到了重要的促進(jìn)作用。本研究以宮頸癌HeLa 細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察虎杖苷對(duì)宮頸癌細(xì)胞的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用效果，并對(duì)其抗宮頸癌機(jī)制進(jìn)行了初步研究。

1 材料

1.1 藥品與儀器 虎杖苷（上海喬羽生物科技有限公司）。RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清（美國(guó)Gibco）；細(xì)胞裂解液（武漢博士德生物工程有限公司）；MTT（美國(guó)Sigma公司）；吖啶橙/溴化乙錠雙熒光凋亡染色試劑盒（上海銘博生物科技有限公司）；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海前塵生物科技有限公司）；兔抗人PI3K，AKT，P-AKT，P70S6K，鼠抗人mTOR（CST，美國(guó)）；FC-500流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckma公司）；轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像分析儀（美國(guó)Bio-Rad司）。

1.2 細(xì)胞株 宮頸癌HeLa細(xì)胞株由濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 以RPMI1640為細(xì)胞培養(yǎng)液（內(nèi)含10%胎牛血清、l00 U·mL^-1青霉素和0.1 g·L^-1鏈霉素），在37 ℃，飽和濕度和5%CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HeLa細(xì)胞。

2.2 MTT法細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞處理后接種于96孔板，隨機(jī)分為空白對(duì)照組（A組）、陰性對(duì)照組（B組）、虎杖苷低劑量組（C組，50 μmol·L^-1）、中劑量組（D組，100 μmol·L^-1）、高劑量組（E組，150 μmol·L^-1）。C，D，E組加入不同濃度虎杖苷10 μL，B組加入等體積DMSO孵育24 h后，各組加入MTT（0.5%），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清液，加入150 μL DMSO，用酶標(biāo)儀490 nm測(cè)定A。抑制率=[（A陰性對(duì)照孔-A實(shí)驗(yàn)孔）/（A陰性對(duì)照孔-A空白對(duì)照孔）]×100%。

2.3 AO/EB雙熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變 按常規(guī)制備細(xì)胞爬片，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分組同MTT實(shí)驗(yàn)，24 h后按試劑盒說(shuō)明書操作，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。

2.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞處理后接種于6孔板，分組處理同MTT實(shí)驗(yàn)，48 h后，制成單細(xì)胞懸液。按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，用FACScan進(jìn)行FCM定量檢測(cè)。

2.5 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞，分組處理同MTT實(shí)驗(yàn)，調(diào)整細(xì)胞濃度1×10⁶⁰個(gè)/mL，用1 mL PBS 重懸，滴加到4 mL預(yù)冷70%乙醇中，4 ℃過(guò)夜固定，離心棄上清，PBS洗3次，加入500 μL RNaseA/PI（50 mg·L^-1），室溫避光30 min，上流式細(xì)胞儀分析。

2.6 RT-PCR檢測(cè)PI3K，AKT，mTOR，P70S6K的mRNA表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞，分組處理同MTT實(shí)驗(yàn)，提取總RNA后合成cDNA，引物序列PI3K：上游5′-CTGTCAATCGGTGACTGTGTGG-3′，下游5′-AAACAGGTCAATGGCTGCATCATA-3′；AKT：上游5′-CTTGCTTTCAGGGCTGCTCA-3′，下游5′-TACAGGTGCTGCGACACGATAC-3′；mTOR：上游5′-AGAAACTGCACGTCAGCACCA-3′，下游5′-CCATTCCAGCCAGTCATCTTTG-3′； P70S6K：上游5′-CTCAGTGAAAGTGGCAATCAGGTC-3′，下游5′-GCTGCCAATAAATCTTCGAGGTG-3′。GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。

2.7 Western blot法檢測(cè)PI3K，AKT，mTOR，P70S6K的蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞，分組處理同MTT實(shí)驗(yàn)，提取總蛋白，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后加一抗（1∶500）4 ℃過(guò)夜，TBST洗膜3次后二抗（1∶2 000）孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，暗室曝光顯影，圖像分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析，組間比較用SNK-q檢驗(yàn)，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 虎杖苷對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用 與A組比較，B組細(xì)胞的增殖無(wú)明顯變化；虎杖苷低、中、高劑量各組細(xì)胞的增殖明顯受抑制（P<0.05），與虎杖苷中劑量組比較，低劑量組的細(xì)胞增殖抑制作用明顯減弱（P<0.05），高劑量組的細(xì)胞增殖抑制作用明顯增強(qiáng)（P<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明虎杖苷對(duì)HeLa細(xì)胞增殖呈明顯劑量依賴性抑制作用（圖1）。

3.2 虎杖苷誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化 A組、B組細(xì)胞均呈圓形，大小一致，核質(zhì)體染成均勻綠色，隨著虎杖苷濃度增加，HeLa細(xì)胞凋亡數(shù)量和結(jié)構(gòu)均發(fā)生明顯改變。C組出現(xiàn)少量核固縮，D組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，部分細(xì)胞出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮呈斑塊狀，核固縮，細(xì)胞呈新月形等，E組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化，凋亡細(xì)胞明顯增多，染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞核碎裂呈點(diǎn)狀或分葉狀，細(xì)胞膜完整和膜泡狀突起等典型的凋亡形態(tài)細(xì)胞（圖2）。說(shuō)明虎杖苷誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡呈明顯劑量依賴性。

3.3 虎杖苷對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的影響 虎杖苷可促進(jìn)宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡，隨著虎杖苷劑量的增大，HeLa細(xì)胞凋亡率顯著增加，各組間差異有顯著性（P<0.05），虎杖苷誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡呈明顯劑量依賴性。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，A，B組細(xì)胞周期無(wú)明顯變化；虎杖苷低、中、高劑量組細(xì)胞均出現(xiàn)G₀/G1期細(xì)胞的百分比逐漸降低而S期細(xì)胞的百分比逐漸增加，呈現(xiàn)S期阻滯作用（P<0.05），與虎杖苷中劑量組比較，低劑量組的S期阻滯作用明顯減弱（P<0.05），高劑量組的S期阻滯作用明顯增強(qiáng)（P<0.05），說(shuō)明虎杖苷對(duì)HeLa細(xì)胞S期阻滯作用呈明顯劑量依賴性（表1）。

3.4 虎杖苷對(duì)HeLa細(xì)胞PI3K，AKT，mTOR，P70S6K的mRNA表達(dá)的影響 與A組比較，B組細(xì)胞PI3K，AKT，mTOR，P70S6K的mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化；虎杖苷低劑量、中劑量、高劑量各組細(xì)胞PI3K，AKT，mTOR，P70S6K的mRNA表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），不同劑量間PI3K，AKT，mTOR，P70S6K的mRNA表達(dá)有明顯差異（P<0.05），說(shuō)明虎杖苷降低HeLa細(xì)胞PI3K，AKT，mTOR，P70S6K的mRNA表達(dá)呈明顯劑量依賴性（圖3）。

3.5 虎杖苷對(duì)HeLa細(xì)胞PI3K，AKT，mTOR，P70S6K的蛋白表達(dá)的影響 與A組比較，B組細(xì)胞PI3K，AKT，mTOR，P70S6K蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化；虎杖苷低劑量、中劑量、高劑量各組細(xì)胞PI3K，AKT，mTOR，P70S6K蛋白表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），不同劑量間PI3K，AKT，mTOR，P70S6K蛋白表達(dá)有明顯差異（P<0.05），說(shuō)明虎杖苷降低HeLa細(xì)胞PI3K，AKT，mTOR，P70S6K蛋白表達(dá)呈明顯劑量依賴性（圖4）。

4 討論

虎杖苷是植物虎杖中提取的一種天然活性成分，屬于芪類化合物，在植物中分布廣泛且含量高?？扇苡跓崴⒁掖?、乙酸乙酷、丙酮，具有多種藥理學(xué)作用。研究表明[10-12]虎杖苷能夠顯著保護(hù)心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞，具有抗血小板聚集及改善微循環(huán)等作用，此外，虎杖苷還具有抗氧化、保護(hù)肝細(xì)胞等作用。虎杖苷能夠顯著抑制乳腺癌、肺癌、肝癌、腎癌等多種癌細(xì)胞生長(zhǎng)[13-14]。本研究首先采用MTT法檢測(cè)不同劑量虎杖苷對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)虎杖苷能夠有效抑制HeLa細(xì)胞增殖，這種抑制作用呈劑量依賴性。

研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期調(diào)控紊亂是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一。細(xì)胞周期是高度有組織的時(shí)序調(diào)控過(guò)程，受到DNA損傷檢控點(diǎn)、DNA復(fù)制檢控點(diǎn)和紡錘體檢控點(diǎn)等細(xì)胞周期檢控點(diǎn)的精確調(diào)控。在嚴(yán)重的DNA損傷狀態(tài)下，細(xì)胞周期阻滯可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控紊亂是腫瘤的特征之一，調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程是控制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的一個(gè)有效的方法[15-16]。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了不同劑量虎杖苷干預(yù)HeLa細(xì)胞的細(xì)胞周期變化，結(jié)果顯示虎杖苷可引起HeLa細(xì)胞發(fā)生S期阻滯，阻斷HeLa細(xì)胞由S期向G₂/M期的進(jìn)程，阻滯細(xì)胞的有絲分裂，促使細(xì)胞調(diào)亡。

凋亡是多細(xì)胞生物體的程序性死亡，在機(jī)體穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中起重要作用，凋亡的調(diào)控失衡是多種疾病如神經(jīng)退行性病變、惡性腫瘤的重要發(fā)病機(jī)制。誘導(dǎo)凋亡是抗腫瘤藥物的主要作用機(jī)制之一，因此，誘導(dǎo)凋亡可作為篩選新的抗腫瘤藥的一個(gè)指標(biāo)及評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物臨床效力一種方法。本研究通過(guò)TUNEL實(shí)驗(yàn)觀察不同劑量虎杖苷干預(yù)HeLa細(xì)胞后，HeLa細(xì)胞的凋亡情況，研究結(jié)果顯示不同劑量虎杖苷均可誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，且凋亡率隨著虎杖苷干預(yù)濃度的增加而增高，呈現(xiàn)明顯劑量依賴性，表明誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡是虎杖苷發(fā)揮抗宮頸癌作用的機(jī)制之一。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路被認(rèn)為是癌細(xì)胞存活的首要通路，有“抗細(xì)胞調(diào)亡途徑”之稱。AKT處于該信號(hào)通路的核心位置，活化的AKT通過(guò)啟動(dòng)下游底物發(fā)揮促細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞調(diào)亡、調(diào)控細(xì)胞周期、促進(jìn)血管生成及化療耐藥等效應(yīng)，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[17-19]。mTOR是PI3K-AKT的下游靶點(diǎn)，主要通過(guò)PI3K-AKT途徑被激活。活化的AKT激活mTOR后，通過(guò)活化其下游蛋白P70S6K，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白的細(xì)絲重構(gòu)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子mTOR與其下游蛋白P70S6K在宮頸癌中表達(dá)均顯著增加[20]。 本研究RT-PCR和Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，虎杖苷呈現(xiàn)明顯劑量依賴性抑制HeLa細(xì)胞PI3K，AKT，mTOR，P70S6K mRNA和蛋白表達(dá)水平，劑量越大其mRNA和蛋白表達(dá)量越低。因此，推測(cè)虎杖苷抑制HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡，其重要的分子作用機(jī)制可能在于虎杖苷可通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白AKT的表達(dá)，繼而影響其下游靶基因mTOR和P70S6K的表達(dá)水平，從而抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)。

綜上所述，虎杖苷能有效抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，將細(xì)胞阻滯在S期，其機(jī)制可能是與抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路及其下游基因蛋白表達(dá)有關(guān)。

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[責(zé)任編輯 張寧寧]