高效液相色譜串聯質譜法測定蜂毒中五種生物胺含量

張文文金玥周金慧

（1中國農業科學院蜜蜂研究所，北京100093；2農業部蜂產品質量監督檢驗測試中心（北京），100093）

高效液相色譜串聯質譜法測定蜂毒中五種生物胺含量

張文文1，2金玥1，2周金慧1，2

（1中國農業科學院蜜蜂研究所，北京100093；2農業部蜂產品質量監督檢驗測試中心（北京），100093）

開發了一種靈敏準確的測定蜂毒中組織胺、多巴胺、5-羥色胺、腎上腺素和去甲腎上腺素含量的高效液相色譜串聯質譜（High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）方法。蜂毒樣品用純水溶解后，離心取上清液，直接上機進行高效液相色譜串聯質譜分析。結果表明，蜂毒樣品中的五種生物胺在0.5～1000 ng/kg范圍內線性良好，R2＞0.998，檢測限和定量限范圍分別為0.09～0.17 ng/kg和0.30～0.59 ng/ kg，在線性范圍內的平均回收率范圍為80.9～111.4%，日內RSD＜7.51%，日間RSD＜10.17%。該方法具有良好的精密度和重現性，并且簡單快速、綠色環保，適用于蜂毒中生物胺的測定。

蜂毒；生物胺；高效液相色譜串聯質譜

蜂毒一種由蜜蜂的毒腺和副毒腺分泌，存儲在毒囊中的有毒液體。當處于危險境況中，蜜蜂即會通過毒針將蜂毒液射入人體或者捕食者體內，這種毒液很容易使人體產生過敏反應，嚴重時危及生命[1]。蜂毒含有活性酶、多肽、碳水化合物、脂質、氨基酸和胺類等多種活性化合物[2]，因此具有抗癌[3]、防輻射[4]、抗菌[5]、消炎[6]和抗突變[7]等多種藥理學性質和生物活性。傳統中醫中，人們成功地使用蜂毒療法減輕由類風濕、多發性硬化癥關節炎關節等引起的慢性疼痛。近幾年，關于蜂毒能夠阻礙白細胞遷移從而抑制局部炎癥，抑制腫瘤細胞的增殖，促進腎上腺皮質激素分泌和改善微循環的集體效應已被發現，因此蜂毒已被廣泛用于某些免疫相關疾病、腫瘤、肌肉骨骼疼痛等疼痛疾病的治療。

組織胺（histamine，His）、多巴胺（dopamine，DA）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、腎上腺素（adrenaline，E）和去甲腎上腺素（noradrenaline，NE）等生物胺是蜂毒中一類重要化合物。組織胺大部分由組氨酸在肥大細胞中脫羧形成，參與中樞和外周神經系統的多種生理功能[8]。多巴胺在腦部分泌，在下丘腦和垂體部位發揮作用，是一種神經遞質[9]。90%以上的5-羥色胺由腸嗜鉻細胞釋放，是一種強力的血管收縮劑和平滑肌興奮劑[10]。組織胺、多巴胺和5-羥色胺分別在中樞神經系統和周邊神經系統中負責不同部門的工作，并且在抑郁癥治療中發揮關鍵作用。腎上腺素和去甲腎上腺素在腎上腺髓質中合成，腎上腺素去甲基化后形成去甲腎上腺素，在緩解頻率心動過緩，低血壓和呼氣性呼吸困難中起到協同作用[11]。

與蜂毒肽或酶的含量相比，蜂毒中生物胺的含量相對低[12]。但是，在蜂毒攝入人體時所引起的疼痛、瘙癢和過敏等反應卻與這類低含量小分子含氮化合物密切相關[13-14]，然而，關于蜂毒中生物胺含量的測定目前尚無研究，因此本研究第一次探索對蜂毒中的組織胺、多巴胺、5-羥色胺、腎上腺素和去甲腎上腺素進行測定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

組織胺（CAS：51-45-6，純度＞99.9%）、多巴胺（CAS：51-61-6，純度＞99.9%）、5-羥色胺（CAS：50-67-9，純度＞99.9%）、腎上腺素（CAS：51-43-4，純度＞99.9%）、去甲腎上腺素（CAS：51-40-1，純度＞99.9%），均購于Sigma公司；甲醇（色譜級）、乙腈（色譜級），購于Fisher Scientific公司；超純水。

Agilent 1290高效液相色譜儀（美國Agilent公司），6495三重四級桿串聯質譜儀（美國Agilent公司），Milli-Q純水發生器（美國Millipore公司），G560E渦旋混勻器（美國Scientific Industries公司），CR22G高速冷凍離心機（日本日立公司）。

1000 μg/ml標準溶液配制：準確稱取5種生物胺標準品10.0 mg，分別溶于10.0 ml色譜純甲醇中，定容至10 ml，得到濃度為1000 μg/ml的標準儲備液，該溶液在4℃冰箱中避光可保存6個月。

標準工作液配制：通過使用純水系列稀釋1000 μg/ml標準儲備溶液，獲得五種生物胺的0.5 ng/ml，5.0 ng/ml，25 ng/ml，100 ng/ml，500 ng/ml和1000 ng/ml標準工作溶液和混合標準工作溶液。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與制備

蜂毒樣品采用電擊法獲得，每隔一周采用輕度電脈沖沖擊刺激蜜蜂，使蜜蜂釋放毒液到蜂毒采集裝置玻璃板上，待晾干呈粉末狀后收集進行冷凍干燥，即為蜂毒凍干粉（crude bee venom lyophilized powder，CBVLP）樣品。所有CBVLP樣品在處理分析前儲存在-20℃的冷凍器中。

1.2.2 蜂毒樣品前處理方法

稱取蜂毒樣品10.0±0.1 g置于5 ml具塞離心管中，加入2 ml純水，渦旋10 min混勻，從離心管中吸取部分蜂毒試樣溶液用純水稀釋25倍，分別取1.0 ml母液和稀釋25倍之后的樣品溶液分別待分析。

1.2.3 HPLC-MS/MS條件

流動相為0.1%甲酸水和甲醇溶液；洗脫條件見表1；PFP色譜柱（100×2.7 mm，3.0 μm，安捷倫），柱溫為30℃；流速為0.3 ml/min；進樣量為2.0 μl。

表1液相梯度洗脫表

霧化器溫度：350℃，霧化器流速：6 l/min，霧化器壓力35 psi，毛細管電壓：2000 V，鞘流氣溫度：350℃，鞘流氣流速：9 l/min，錐孔電壓：1000 V。目標化合物的母離子、子離子、傳輸電壓和碰撞能量見表2。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理優化

生物胺的極性很大，因此高水溶性而低溶于脂肪。所以實驗中對比了純水、乙腈和甲醇等不同極性萃取劑對化合物的提取效率。比較發現，純水顯示出更高的提取效率和更少的基質效應。與其他兩種有機溶劑相比，純水也更環保，對實驗人員造成的危害更小。因此，選擇純水作為最佳提取劑。

2.2 HPLC-MS/MS條件優化

由于組織胺、5-羥色胺、多巴胺、腎上腺素和去甲腎上腺素的結構特征（圖1）十分相似，所以需要通過優化色譜條件以獲得五種生物胺較高的響應值、最佳的分離、尖銳的峰形以及適當的保留時間。首先對比了兩種常用的有機相乙腈和甲醇對生物胺的洗脫能力，在極性比較大的乙腈洗脫下，五種生物胺表現出更好的響應值和分離度。然而，乙腈作為有機相時組織胺的保留時間比較靠前，在體積內出峰，這種情況下將會由于內源性雜質的干擾而導致不準確的定量和鑒定。因此，選擇甲醇作為有機流動相，以增加溶質保留并提高分辨率。

表2質譜參數

圖1五種生物胺的化學結構式

五種生物胺的在電噴霧離子源正模式（Electronic Spray Ion，ESI）下的離子化效率，通過在水相流動相中加入甲酸或乙酸來提高。實驗中對比了甲酸的比例從0.05%變化到0.5%時，五種生物胺的在儀器中的響應值高低和峰形的尖銳程度。最終，選擇0.1%甲酸水和甲醇的組合作為最佳流動相。優化適當的梯度洗脫程序，不僅可以增加目標分析物的響應值，還可以縮短總體的運行時間。為了使五種生物胺的保留時間合適并且完全分離，甲醇的比例在0～98%改變，8分鐘內五種生物胺出峰完畢。

表3方法標準曲線線性范圍、相關系數、檢測限和定量限

五種生物胺（5.0 μg/g）的單標工作溶液直接進入質譜進行過渡，以獲得最強豐度的分子離子峰。每種化合物在全掃描模式（Scan）下選取一個母離子，并優化傳傳輸電壓（Fragmentor）將選取的母離子以最高的效率送入二級質譜中；在選擇離子模式（selected ion mode，SIM）下選取兩個子離子，并優化合適的碰撞能量（Collision energy，CE）得到最大強度的子離子色譜峰。同時，為了在MRM模式下獲得最佳響應值，試驗中對駐留時間、氣體溫度、干燥氣體流速、霧化器壓力、毛細管電壓、鞘氣溫度、鞘氣流量和噴嘴電壓等參數進行了微調。在1000V～3500V范圍內對毛細管電壓進行優化，由于目標化合物的分子量很小，易發生源內碎裂解，所以選擇2000V作為最佳毛細管電壓。同時，實驗中去甲腎上腺素由于在離子源的高溫環境下容易失去一個H2O，所以其母離子選擇 m/z 152.1，而非 m/ z170.1。基于HPLC-MS/MS分析的五種生物胺的MRM圖譜見圖2。

圖2 5種生物胺的MRM色譜圖（10μg/kg）

3 方法驗證

為了評估開發方法的性能，研究從選擇性、線性、檢測限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quan－titation，LOQ）、回收率和精密度方面對方法進行了評價驗證。

表4方法的回收率和日內、日間RSD

由于缺乏空白樣品，質譜檢測器中色譜峰很可能受到來自基質的其他內源性組分的干擾。測定峰純度的一種簡單方法是用二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）[15]記錄的光譜進行比較，通過DAD檢測器在190～400 nm波長范圍上覆蓋蜂毒液樣品中的組織胺、多巴胺、5-羥色胺、腎上腺素和去甲腎上腺素的每個峰的光譜，得以確認該方法的選擇性。

實驗中以加標樣品和對照樣品之間的分析物峰面積的差值為縱坐標，添加濃度為橫坐標，繪制標準校正曲線y=kx+b，其中y指峰面積（y=yn-y0；yn是添加樣品中目標化合物的峰面積，y0是對照樣品中對應化合物的峰面積），x為添加樣品中的添加量。為了提高較低濃度范圍的精確度，將加權因子1/x應用于所有校準曲線，每個校準曲線包含6個濃度。在濃度范圍0.5～1000 ng/ml內線性良好，相關系數R2＞0.998。

通過標準曲線獲得的斜率（k）和y截距的標準偏差（S）計算所有分析物的LOD和LOQ，并以此評價方法靈敏度（LOD=3S/k；LOQ=10S/k）[12]。基于該方程，5種生物胺的LODs和LOQs值分別確定為：組織胺0.09μg/kg和0.31μg/kg；多巴胺0.17μg/kg和0.59μg/ kg；5-羥色胺0.10μg/kg和0.30μg/kg，腎上腺素0.17μg/ kg和0.56μg/kg，去甲腎上腺素為0.14μg/kg和0.45μg/ kg。

回收率在三個添加濃度（多巴胺、5-羥色胺、腎上腺素和去甲腎上腺素：0.2 μg/kg，2.0 μg/kg和20.0 μg/ kg；組織胺2.0 μg/kg，20.0μg/kg和200.0μg/kg）下獲得。分別測定質控樣品（C），加入三種濃度標準溶液的質控樣品（B）和響應濃度的標準溶液（A）的目標化合物濃度，通過公式[(B-C）/A]×100計算回收率，五種化合物在蜂毒樣品中的回收率高于80.95%，方法精密度由回收率的日內和日間相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）來評價，日內RSD范圍為0.17～7.51%之間，5批次的日間RSD小于10.17%，符合要求，說明該方法準確可靠，適用于蜂毒中五種生物胺的定性定量分析。

4 結論

本研究第一次采用高效液相色譜串聯質譜方法對蜂毒中的組織胺、多巴胺、5-羥色胺、腎上腺素和去甲腎上腺素進行了定性定量分析，樣品制備程序簡單環保，分析方法靈敏度高，重現性好，準確可靠，對于今后采用生物胺含量的差異對不同亞種蜂毒進行鑒別提供技術支撐。

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Determination of five ammonia amines in bee venom by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

Zhang Wenwen1，2，Jin Yue1，2，Zhou Jinhui1，2
（1 Institute of Apicutural Research,Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100093；2 Bee Product Quality Supervision and Testing Center Ministry of Agriculture，Beijing 100093）

A high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for the determination of histamine,dopamine,serotonin,epinephrine and norepinephrine in bee venom was developed.Bee venom samples were dissolved in pure water,centrifuged to take the supernatant,and analyzed by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry.The results showed that the five kinds of biogenic amines in the venom samples were linear in the range of 0.5～1000 ng/kg,R2＞0.998,the limitsof detection and the limits of quantification were 0.09～0.17 ng/kg and 0.30～0.59 ng/kg,the average recoveries range in the linear range is 80.9～111.4%,intraday RSD＜7.51%,interday RSD＜10.17%.The method has good precision and reproducibility,and is simple and rapid,green,suitable for the determination of biogenic amines in bee venom.

bee venom,biogenic amines,high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

張文文（1991-），女，碩士，蜂產品質量安全與分析，E-mail：bijihaierla@163.com

金玥（1985-），女，博士，蜂產品質量安全與分析，E-mail：yue_yue_jin@126.com；周金慧（1977-），男，博士，蜂產品質量安全與分析，E-mail：zhoujinhui@caas.cn