紅景天苷對野百合堿誘導肺動脈高壓大鼠RhoA/Rho激酶信號通路的影響*

薛運昕,寧 欣,郭天聰,倪 楠,蔡昕姝

遼寧省金秋醫院呼吸科(沈陽 110016)

紅景天苷對野百合堿誘導肺動脈高壓大鼠RhoA/Rho激酶信號通路的影響*

薛運昕,寧 欣,郭天聰,倪 楠,蔡昕姝

遼寧省金秋醫院呼吸科(沈陽 110016)

目的：探討紅景天苷對肺動脈高壓大鼠的肺組織病理與RhoA/Rho激酶信號通路的影響。方法：將30只6～8周齡雄性SD大鼠隨機分為五組：正常對照組、模型對照組、低濃度組、中濃度組、高濃度組；除正常對照組注射對照溶劑外，其余組皮下注射60 mg/kg野百合堿，2～28 d后，對低、中、高濃度組分別注射50、100、200 mg/(kg·d)紅景天苷，對照組注射生理鹽水；實驗結束，分別檢測各組右心室收縮壓(RVSP)及右心室肥厚指數；HE染色檢測大鼠肺組織病理變化，RT-PCR檢測肺組織ROCK1 、RhoA mRNA表達水平，Western blot檢測肺組織RhoA、ROCK1、p-MYPT1蛋白表達及磷酸化水平。結果：與正常對照組比較，模型對照組RVSP及右心室肥厚指數顯著上升，肺組織RhoA 、ROCK1 mRNA顯著上調，ROCK1、RhoA、p-MYPT1蛋白表達及磷酸化水平顯著上調；不同濃度紅景天苷干預后，各組RVSP及右心室肥厚指數出現變化，高濃度組顯著下調；肺組織RhoA 、ROCK1 mRNA逐漸下調，RhoA、ROCK1、p-MYPT1蛋白表達及磷酸化水平逐漸下調，呈濃度依賴，中、高濃度組變化顯著。結論：一定劑量紅景天苷能夠緩解野百合堿誘導的大鼠肺動脈高壓，可能與其對RhoA/Rho激酶信號通路抑制有關。

肺動脈高壓(Pulmonary artery hypertension，PAH)是一類由于肺動脈血壓升高、肺血管重塑引起的以右心室肥大、右心功能不全為特征的疾病，發病機制尚未完全闡明[1]。研究發現RhoA/Rho激酶信號通路介導的各種細胞功能可能參與PAH的形成及發生發展各階段[2-4]。中藥紅景天具有保護神經及心血管系統、調節機體代謝，延緩衰老等重要作用，在PAH的臨床應用已經開展初步研究，但是對于相關分子機制的探討還很少見[5-6]。本實驗將以野百合堿誘導的PAH大鼠為模型，探討其主要活性成分紅景天苷(Salidroside，Sal)對大鼠肺組織病理與肺動脈重構的影響，以及RhoA/Rho激酶信號通路在其中的可能調節作用。

材料及方法

1 主要材料及試劑 雄性SD大鼠，6～8周齡；野百合堿、紅景天苷均購自大連美侖；M-MLV反轉錄酶、高純總RNA快速提取試劑盒購自Bioteke(北京)；ROCK1、β-actin多克隆兔抗抗體購自萬類生物(沈陽)，RhoA、p-MYPT1多克隆兔抗抗體購自Bioss(北京)；辣根過氧化物酶HRP標記羊抗兔二抗購自碧云天(海門)；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自萬類生物(沈陽)；生物機能實驗系統(成都)。

2 動物建模及分組 選取6～8周齡、健康SD大鼠30只，隨機分為正常對照組，模型對照組，低濃度組、中濃度組、高濃度組；模型及藥物處理組大鼠皮下注射60 mg/kg 野百合堿(600mg野百合堿溶于4ml無水乙醇與生理鹽水混合物中，無水乙醇∶生理鹽水=2∶8)，正常對照注射等量溶劑(無水乙醇∶生理鹽水=2∶8)。第2～28天腹腔注射低(50 mg/kg)、中(100 mg/kg)、高(200 mg/kg)濃度紅景天苷干預，其他組注射等體積生理鹽水。第28天，檢測大鼠各項指標，處死所有大鼠并取材，部分固定于4%多聚甲醛溶液中，部分液氮速凍轉至-70℃冰箱中保存。

3 血流動力學指標檢測 將各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.5ml/kg)麻醉，仰臥位固定于手術臺上，頸部去毛消毒，手術剪剪開皮膚，分離右側頸外靜脈，經頸外靜脈插管至右心室，接壓力換能器連接生物機能實驗系統，記錄大鼠右心室收縮壓(RVSP)。

4 組織病理學觀察 大鼠測壓后處死，開胸取心臟，去除左右心房及大血管，分離右心室游離壁組織(RV)及左心室+室間隔組織(LV+S)，沖洗去除殘留血液，濾紙吸凈表面水分，稱重并計算右心室肥厚指數(RV/(LV+S))；分離氣管并結扎左肺葉，多聚甲醛灌注右肺進行固定，常規石蠟包埋，切片，HE染色，觀察細小動脈病理改變。

5 RT-PCR檢測大鼠肺組織RhoA 、ROCK1 mRNA表達 收集各組大鼠肺組織樣本，利用總RNA提取試劑盒提取大鼠肺組織RNA，經M-MLV逆轉錄酶反應合成cDNA第一鏈，加入相應檢測引物進行PCR檢測肺組織RhoA 、ROCK1基因mRNA表達水平，根據NCBI數據庫提供的目標基因序列信息，RhoA上游引物序列：5’- TCGGAATGATGAGCACACAA -3’；下游引物序列： 5’- GCTTCACAAGAT AGGCAC -3’；ROCK1上游引物序列：5’- GATGGCTATTATGGACGAG -3’；下游引物序列：5’- TCTGCCCAATCTCACTTC -3’；內參為β-actin上游引物序列： 5’- GGAGATTACTGCCCTGGC CCTAGC -3’；下游引物序列 ： 5’GGCCGGACTCATCGTACTCCTGCTT -3’；PCR反應條件如下：95℃，預變性5min；95 ，變性30 s；56℃，退火30 s；72℃，延伸30 s；循環數30。對所獲得PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，分析掃描光密度數值，計算ROCK1 、RhoA的相對表達量。

6 Western blot檢測大鼠肺組織ROCK1、RhoA、p-MYPT1蛋白表達及磷酸化水平 對各組大鼠肺組織樣本利用RIPA裂解液勻漿裂解，提取蛋白，BCA蛋白濃度檢測試劑盒進行蛋白定量，并調整蛋白濃度，每組樣本以20 μl進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉法低溫轉印，一抗(ROCK1、RhoA、p-MYPT1均1∶500稀釋)4℃孵育過夜，經TBST洗滌3次，加入HRP標記羊抗兔二抗(1∶5000稀釋)于37 ℃孵育45 min，經TBST洗滌3次，灑入ECL發光液適量，反應約5 min，放于暗室中對膠片進行曝光、顯影、定影，掃描膠片采集灰度值，以β-actin做為內參進行校正，以正常對照組條帶灰度值為1，其他組別條帶灰度值與之進行比較，所得數值即為目標蛋白相對表達量。

結 果

1 右心室收縮壓(RVSP)及右心室肥厚指數變化 與正常對照組比較，造模28 d后，模型對照組RVSP明顯上升(P<0.05)，提示造模成功；給予紅景天苷干預后，中、低濃度組大鼠RVSP變化無統計學差異，但高濃度組降低程度顯著，與模型組比較存在統計學意義(P<0.05)；正常對照組及模型對照組大鼠RV/(LV+S)比較，存在統計學差異(P<0.05)，不同濃度梯度紅景天苷干預后，中、低濃度組大鼠RV/(LV+S)變化無統計學差異，但高濃度組降低程度顯著，與模型組比較具有統計學差異(P<0.05)，見表1。

2 大鼠肺組織病理學變化 正常對照組大鼠肺組織部位細小肺動脈內膜結構完整，平滑肌層細胞無增厚現象，細胞與胞核排列比較規整，未出現炎癥細胞浸潤；而模型對照組大鼠肺組織血管周圍出現大量淋巴細胞與中性粒細胞，存在明顯炎性細胞浸潤現象，平滑肌全層增厚，細胞排列較為紊亂；在不同濃度梯度的紅景天苷藥物干預后，各組大鼠肺組織炎性細胞浸潤有所減輕，肺細小血管重塑情況得到改善，其中以高濃度組變化最為明顯(圖1)。

表1 各組大鼠血流動力學及病理學指標比較±s)

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，△P<0.05

A：正常對照組；B：模型對照組；C：低濃度組；D：中濃度組；E：高濃度組

3 RT-PCR檢測肺組織ROCK1 、RhoA mRNA表達 與正常對照組比較，模型對照組大鼠肺組織ROCK1 、RhoA mRNA表達水平顯著上調(P<0.05)；不同濃度梯度紅景天苷干預后，各組大鼠肺組織ROCK1 、RhoA mRNA表達水平逐漸降低，呈濃度梯度依賴，中、高濃度組與模型對照組比較具有統計學意義(P<0.05)。

4 Western blot檢測肺組織ROCK1、RhoA蛋白表達及MYPT1磷酸化 與正常對照組比較，模型對照組大鼠肺組織中ROCK1、RhoA表達及MYPT1磷酸化顯著上調(P<0.05)；不同濃度梯度紅景天苷干預后，各組大鼠肺組織中ROCK1、RhoA表達及MYPT1磷酸化水平逐漸下降，呈濃度梯度依賴，與模型對照組比較具有統計學意義(P<0.05)。

A：肺組織ROCK1、RhoA mRNA表達；B：肺組織ROCK1 、RhoA mRNA相對表達量；與正常對照組，*P<0.05；與模型對照組，△P<0.05

圖2 肺組織ROCK1 、RhoA mRNA表達情況

A：肺組織ROCK1 、RhoA蛋白表達及MYPT1磷酸化情況；B：肺組織ROCK1 、RhoA蛋白表達及MYPT1磷酸化相對量

圖3 肺組織ROCK1、RhoA蛋白表達及MYPT1磷酸化情況(與正常對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，△P<0.05)

討 論

Rho屬于小G蛋白家族，通過激活下游Rho激酶蛋白調節細胞黏附、遷移、增殖、凋亡等多種生物學行為[7]。Rho激酶(ROCK)包括ROCK1及ROCK2兩種異構體，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，是RhoA的下游效應分子，接收RhoA介導的活化信號，調控下游一系列信號傳遞，調節細胞多種生物學功能[8]。血管平滑肌細胞的正常功能保證了血管的收縮平衡。RhoA-Rho激酶信號通路對血管平滑肌細胞的收縮具有重要的調節作用，該信號的異常激活與多種血管疾病存在密切聯系[9]。

最近研究發現，RhoA-Rho激酶信號通路參與了PAH的形成。Abe[10]等報道，作為選擇性Rho激酶抑制劑，Y-27632或法舒地爾能夠顯著降低PAH模型大鼠的血管持續性收縮反應以及血管重建，抑制野百合堿介導的PAH大鼠肺血管平滑肌細胞增殖并誘導細胞凋亡。Xu[11]等也發現Y-27632能夠顯著降低低氧引起的新生小鼠右心室肥厚，逆轉動脈血管壁重建。Tawara S等報道了Rho激酶抑制劑與前列腺環素聯用有利于改善野百合堿介導的PAH大鼠右心室肥大以及肺血管中層增厚[12]。本實驗發現，經過野百合堿刺激后，由于肺動脈壓力增加及肺血管重構，模型對照組大鼠肺組織中RhoA蛋白表達水平上調，Rho激酶(ROCK1)表達上升，Rho激酶調節亞單位(MYPT-1)磷酸化水平增加，提示Rho激酶在大鼠PAH模型中活性增強，RhoA-Rho激酶通路可能參與了PAH的發生以及肺血管的重構，與文獻中報道一致。紅景天苷是藏藥紅景天中提取的苯乙醇類化合物，也是發揮主要作用的有效成分，具有保護心腦血管系統、抗疲勞、抗腫瘤等多重藥理作用，具有較為廣泛的應用前景[13]。本實驗中，對野百合堿處理的大鼠給予紅景天苷干預后，隨著藥物濃度增加，與模型對照組大鼠比較，高濃度藥物干預組大鼠RVSP及右心室肥厚指數存在顯著降低，具有統計學差異；大鼠肺組織炎性細胞浸潤程度逐漸減弱，肺細小血管重塑情況得到改善，與藥物濃度呈正相關；紅景天苷的上述效應可能與多種信號通路有關。本實驗中通過RT-PCR及蛋白免疫印跡實驗檢測發現藥物處理組大鼠肺組織RhoA、ROCK1 mRNA及蛋白表達水平逐漸降低，p-MRPT1水平逐漸降低，呈濃度梯度依賴。

本論文研究證明，紅景天苷對野百合堿所致PAH大鼠模型具有一定治療作用，可能與其抑制RhoA、ROCK表達水平，抑制RhoA/ROCK激酶通路的激活而逆轉PAH以及肺血管重構有關，紅景天苷有可能為延緩肺動脈高壓進展提供一種新的選擇。

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(收稿：2016-08-18)

Effect of Salidroside on the signal pathway of RhoA/Rho kinase in monocrotaline -induced pulmonary hypertension in rats

Xue Yunxin，Ning Xin,Guo Tiancong,et al.

Jinqiu Hospital of Liaoning Province(Shenyang 110016)

Objective: To investigate the effect of salidroside on RhoA/Rho kinase signaling pathway on lung tissue pathology in rats with pulmonary hypertension.Methods: The thirty 6-8 week old male SD rats were randomly divided to 5 groups: normal control group, model control group, low concentration group, middle concentration group, the high concentration group. In addition to the normal control group, the other groups were injected with 60 mg/kg of monocrotaline. in 2-28 day, the rats in low concentration group, medium concentration group and high concentration group were injected with salidroside at 50, 100, 200 mg/kg/d, respectively, the control group rats were injected with normal saline. At the end of the experiment, the right ventricular systolic pressure (RVSP) and the right ventricular hypertrophy index were detected in each group. The pathological changes of lung tissue were detected by HE staining in rats. The mRNA expression level of ROCK1 and RhoA in lung tissue was detected by RT-PCR. The protein expression level of ROCK1,RhoA and and phosphorylation of MYPT1 in lung tissue was detected by Western blot. Results: Compared with the normal control group, in model control group rats,the RVSP and right ventricular hypertrophy index increased significantly, the RhoA and Rock1 mRNA in lung tissue was significantly up-regulated, the protein expression of RhoA,Rock1, and p-MYPT1 were significantly up-regulated. After treatment with different concentrations of salidroside, the changes of RVSP and right ventricular hypertrophy index were significantly lower in the high concentration group. The expression of RhoA and ROCK1 mRNA in lung tissue was gradually down regulated, and the expression and phosphorylation of RhoA,ROCK1, p-MYPT1 were gradually down regulated, which was concentration dependent, and the change of medium and high concentration groups was significant.Conclusion: A certain dose of salidroside can alleviate the pulmonary hypertension induced by monocrotaline, which may be related to the inhibition of the RhoA/Rho kinase signaling pathway.

@Pulmonary artery hypertension Salidroside Rhodioloside/pharmacology @RhoA/Rho kinase Monocrotaline Rats

*遼寧省直醫院改革重點臨床科室診療能力建設項目青年項目(LNCCC-D37-2015)

@肺動脈高壓 紅景天苷/藥理學 @RhoA/Rho激酶 野百合堿 大鼠

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.07.004