PAR1、PAR4在宮頸癌中的表達及臨床意義

侯麗娟，翟建軍

首都醫科大學附屬北京同仁醫院婦產科(北京 100176)

·臨床病理·

PAR1、PAR4在宮頸癌中的表達及臨床意義

侯麗娟，翟建軍△

首都醫科大學附屬北京同仁醫院婦產科(北京 100176)

目的：對宮頸癌組織中PAR1和PAR4基因的表達進行檢測，并對其相關的臨床意義進行探討。方法：選取宮頸癌患者手術切除標本84例，所有病例經病理確診，對照為癌旁非癌宮頸組織。對患者的年齡、有無淋巴結轉移、腫瘤分化程度及臨床TNM分期分組對照HPV16和P16基因的表達。RT-PCR檢測PAR1和PAR4 mRNA的表達，熒光定量PCR檢測PAR1和PAR4基因的表達量。結果：宮頸癌標本中PAR1和PAR4基因的表達率分別為63.1%和72.6%，顯著高于癌旁正常對照宮頸組織的21.4%和29.8%(P均<0.01)。PAR1和PAR4基因在宮頸癌標本中的表達量分別為0.61±0.15和0.67±0.17，也顯著高于對照組織的0.13±0.07和0.21±0.08(P均<0.01)。PAR1和PAR4基因的表達率和表達量在患者腫瘤分化程度、有無淋巴結轉移及臨床不同分期之間都存在統計學差異(P<0.05)，但不同年齡患者之間無統計學差異(P>0.05)。相關性分析顯示宮頸癌組織中PAR1和PAR4基因的表達呈正相關(r=0.664，P<0.01)。結論：PAR1和PAR4基因的高表達在宮頸癌的發生發展中起到一定的作用，對其聯合檢測有可能用于宮頸癌分化程度的評估、臨床分級以及判斷預后等方面。

據調查顯示，世界各國的腫瘤發病率及病死率逐年升高，目前已成為繼心血管病之后現代人類的第二大殺手[1]。在女性的惡性腫瘤中,宮頸癌的發生率僅次于乳腺癌，全世界每年約有50萬婦女患病，居女性生殖道腫瘤發病首位，且有年輕化的趨勢。對婦科腫瘤的準確診斷及正確的預后判斷是近年研究關鍵點[2-3]。蛋白酶激活受體 (Protease activated receptors, PARs) 是一個G蛋白偶聯受體家族，有PAR1-4四個成員組成，PARs激活后可以級聯激活G蛋白調控下游通路的轉導刺激細胞增殖、腫瘤形成和轉移，PAR1-3由凝血酶激活，而PAR2由胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶激活[4-5]，目前PAR1研究的比較多，主要集中在黑色素瘤方面，而PAR4則較少涉及[6]。本文對宮頸癌患者組織中PAR1、PAR4基因的表達情況進行檢查，并對其與宮頸癌的關系及相關的臨床意義進行探討，現報告如下。

材料與方法

1 標本來源 選取我院2010年1月至2016年6月婦產科行手術治療的宮頸癌患者手術切除標本84例，并經術后病理學診斷證實確診為宮頸癌，其中年齡 36～76 歲，平均年齡(59.2±13.1)歲。根據臨床TNM分期劃分：I 期患者12例、Ⅱ期患者20例、Ⅲ期患者 31例、Ⅳ期患者 21例，同時每例另取癌旁非癌的正常宮頸組織的鱗狀上皮制成標本作為對照。所有入選病例術前均未接受放療、化療或其他生物治療。

2 主要試劑和儀器 采用Trizol、RT-PCR試劑盒(購自于北京天根生化科技有限公司)及SYBR Green熒光定量檢測試劑盒(購自于大連寶生物公司)。主要儀器有：石蠟切片機、離心機，免疫組化專用濕盒、光學顯微鏡、恒溫箱、冰箱等等。

3 組織的提取及合成

3.1 組織總RNA提取的方法：首先取50～60mg實驗腫瘤或癌旁，在液氮中研磨勻漿后，加入1 ml Trizol提取細胞總RNA，并嚴格按照試劑盒說明書進行操作，具體方法如下：吸取實驗組織裂解物置入干凈的1.5ml EP管加入0.2 ml氯仿，在劇烈振蕩15 s 后，放置室內15 min，12, 000 rpm 4°C離心15 min，小心吸取上清置入另一支干凈的EP管中。在上清中加入0.5 ml異丙醇，顛倒混合后，室溫靜置10 min后，12 000 rpm 4°C離心10 min，將75% 乙醇輕輕顛倒洗滌沉淀2次，然后加入DEPC水溶解，用紫外分光光度計來測定細胞總RNA在260 nm和280 nm處的光密度值(OD)，同時計算RNA的含量及純度。

3.2 cDNA第一鏈合成的方法：反轉錄合成cDNA第一鏈：2 μg RNA，2 μl Olig (dT)15，1mM dNTP mixture，5mM DTT，200U TIANScript M-MLV，40 U RNasin，4 μl 5×First-Strand Buffer，加入DEPC處理滅菌蒸餾水至總反應體系20 μl。在40 °C 下孵育1 h，在95°C時孵育5 min中止反應，取其樣品-70°C凍存。

4 RT-PCR步驟

4.1 PCR反應擴增目的片段：2 μl cDNA，0.2 μl Primer F (50 μΜ)，0.2 μl Primer R (50 μΜ)，12.5 μl2× Taq Plus MasterMix，加ddH2O至總反應體系25 μl。

擴增片段：PAR1：Sence:5'- TTCAGTCTGTGCGGCCCGCTGTT-3'

Antisence: 5'-CCAGGTGCAGCATGTACACCACC -3'；PAR4：Sense: 5'- GGCAACCTCTATGGTGCCTA -3', antisense: 5'- TTCGACCCAGTACAGCC TTC-3'；β-actin: Sence: 5'- TCGGAGTCAACGGATTTGGTCGTA-3'，Antisence: 5'- AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGA-3'。

4.2 擴增反應的條件：94°C 5 min，94°C 30 s，60°C 40 s，72°C 1 min，35個循環； 72°C 10 min。100V 2% 瓊脂糖凝膠電泳45 min，凝膠成像儀拍照。

5 實時定量熒光PCR (Real-Time PCR) 參照SYBR Green Real-time PCR檢測試劑盒的使用說明書進行操作，采用ABI Prism7500熒光定量PCR儀來檢測PAR1、PAR4基因的表達情況。0.2ml PCR反應管加入上下游引物，反應條件為：95C 1min；95C 15s， 60C 15s，72C 20s，35個循環。以β-actin基因作為內參照。PAR1：Sence:5'- CCTTCATCTACTACTACTACGTGTCG-3'

Antisence: 5'- ACTGGAGCAAAGAGGAGTGG -3'；PAR4：Sense: 5'- GGCAACCTCTATGGTGCCTA -3', antisense: 5'- TTCGACCCAGTACAGCC TTC-3'；β-actin: Sence: 5'- ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3'，Antisence: 5'- GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3'。Ct值表示基因擴增達到閾值的循環數，當 Ct值越小時表明該基因的表達就越多，顧根據內參的Ct值能夠計算出△Ct值即△Ct值=目的基因Ct值-內參基因Ct值，通過△Ct值能夠間接的反映出目的基因的相對表達水平，目的基因的表達量采用2-△Ct來評估。

結 果

1 兩組在PAR1和PAR4表達上的比較 檢測結果顯示，84例宮頸癌標本中檢出PAR1基因的表達53例(63.1%)，癌旁正常對照組織PAR1基因檢出18例，檢出率為21.4%，經統計學分析，兩組比較有統計學差異(P〈0.01)。宮頸癌標本中檢出PAR4基因的表達61例(72.6%)，而癌旁正常對照組織僅有25例檢出PAR4基因，表達率為29.8%，兩組之間比較有統計學差異(P<0.01)，見表1。

Real-Time PCR結果顯示，PAR1基因在宮頸癌標本和正常對照組織中的表達量分別為0.61±0.15和0.13±0.07，兩組之間比較有統計學差異(P<0.01)；PAR4基因在宮頸癌標本和正常對照組織中的表達量分別為0.67±0.17和0.21±0.08，兩組之間的表達量比較亦有統計學差異(P<0.01)。

2 PAR1和PAR4與病理學的關系 患者腫瘤的分化程度、有無淋巴結轉移和臨床TNM不同分期與PAR1、PAR4基因的表達之間存在統計學差異(P<0.05)，而與患者的年齡之間無統計學差異(P>0.05)，見表2。

表1 PAR1和PAR4基因在良、惡性宮頸組織中的表達[例(%)]

注：與對照組比較，*P<0.01

表2 宮頸癌組織中臨床指標與PAR1和PAR4 mRNA表達之間的關系

注：不同臨床指標兩組之間比較，*P<0.05，△P<0.01

3 宮頸癌組織中PAR1和PAR4基因表達的相關性分析 Spearman等級相關分析顯示宮頸癌組織中PAR1和PAR4基因的表達呈正相關(r=0.664，P<0.01)。

討 論

腫瘤的發生發展是一個多階段、多因素、多步驟、多基因的漫長演化過程。蛋白酶激活受體(PAR)1、4是凝血酶的下游靶蛋白，在多種實體腫瘤中表達上調，例如黑色素瘤、乳腺癌、肝癌等，另外凝血酶本身對腫瘤的生長和轉移具有促進作用，并且還可以刺激腫瘤血管的生成，提示了PAR1和PAR 4在惡性腫瘤中的檢測意義重大[7]。PAR1和PAR 4具有7個跨膜單位，只有在胞外區水解后，受體的胞內區才能發揮活性，其主要是通過調節G蛋白的下游信號轉導通路來發揮生物學特性，例如激活Src激酶活化Erk通路；增加EGFR的磷酸化；活化NF-κB通路；激活MMPs途徑等，上述的信號通路都與腫瘤的發生和發展有著密切的關系[8]。我們對宮頸癌組織PAR1和PAR 4基因表達的檢測顯示癌組織中PAR1和PAR 4基因的表達率和表達量顯著高于癌旁對照宮頸組織(P<0.01)，提示了PAR1和PAR 4基因的激活在宮頸癌發生中起重要作用。

有研究顯示PAR-1可以通過調節縫隙連接蛋白Connexin 43和腫瘤抑制基因Maspin的表達來促進腫瘤的轉移，并且使用凝血酶或者PAR-1的激活劑可以喚醒處于休眠期的腫瘤細胞，誘導細胞的有絲分裂，增加細胞的侵襲和遷移能力，在一項胃癌的研究中顯示PAR-1的表達與腫瘤的侵犯和淋巴結轉移密切相關[9-10]。在肝癌中的研究顯示PAR-4的拮抗劑可以減弱凝血酶介導的肝癌細胞的侵襲、轉移活性，顯示PAR-4可以作為一個腫瘤治療的靶點[5]。上述的研究提示PAR1和PAR 4有可能成為腫瘤轉移和預后評估的有效標志，值得進一步深入研究。本研究結果顯示，PAR1、PAR4基因的表達與宮頸癌分化程度、有無淋巴結轉移和臨床不同分期之間存在統計學差異(P<0.05)，并且PAR1和PAR4的表達有隨著腫瘤分化程度的減低，淋巴結的轉移和臨床分期的進展而表達逐漸增加的趨勢，這表明PAR1和PAR4在宮頸癌的惡性程度判定上具有一定的敏感性，能夠預示著患者的預后。另外相關性分析顯示PAR1和PAR4在宮頸癌中的表達呈正相關，提示PAR1和PAR4的聯合檢測將會提高二者的臨床應用價值。

綜上所述，PAR1和PAR4在宮頸癌的發生發展中具有一定的作用，對腫瘤的分級、判斷預后等方面有指導意義，值得臨床上進一步研究和探討。

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(收稿：2016-12-12)

The expresssion of PAR1 and PAR4 in human cervical carcinoma and its clinical significance

Hou Lijuan,Zhai Jianjun.

Department of Obstetrics and Gynecology,Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University(Beijing 100176)

Objective：To investigate the mRNA expression and clinical significance of protease activated receptor1(PAR1) and protease activated receptor4(PAR4) in human cervical carcinoma. Methods：84 patients were enrolled in our study. The cervical carcinoma tissues and adjacent normal cervical tissues were collected for RT-PCR and Real-time PCR analysis. Results：The positive expression rates of PAR1 were 63.1% and 21.4% in cervical carcinoma and normal tissues, respectively(P<0.01). The positive expression rates of PAR4 were 72.6% and 29.8% in cervical carcinoma and normal tissues, respectively(P<0.01). Real-time PCR analysis showed that the 2-△Ctvalues of PAR1 were 0.61±0.15 and 0.13±0.07 in cervical carcinoma and normal tissues, respectively(P<0.01). The 2-△Ctvalues of PAR4 were 0.67±0.17 and 0.21±0.08 in cervical carcinoma and normal tissues, respectively(P<0.01). The mRNA expression of PAR1 and PAR4 was significant related with differentiation,lymphatic metastasis, and clinical pathologic stage in human cervical carcinoma(P<0.05). The mRNA expression of PAR1 was positively related to that of PAR4 (r=0.664，P<0.01). Conclusion：The overexpression of PAR1 and PAR4 have a closed relationship with the development of human cervical cancer. The combined detection of PAR1 and PAR4 might be used as the marks for estimating the prognosis of cervical carcinoma.

Uterine cervical neoplasms/pathology Receptors,proteinase-activated/analysis

子宮頸腫瘤/病理學 受體，蛋白酶激活/分析

R363

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.07.052

△通訊作者