缺氧誘導因子1對糖尿病狀態下血管內皮細胞表面細胞間粘附分子-1表達的調節*

田冰玉，宋虎平

西安市第四醫院眼科(西安 710004)

田冰玉，宋虎平△

西安市第四醫院眼科(西安 710004)

目的 ： 探討早期糖尿病視網膜病變(DR)狀態下，缺氧誘導因子1(HIF-1)對血管內皮細胞表面細胞間粘附分子-1(ICAM-1)表達的影響。方法 ：收集早期DR患者及年齡匹配的健康人外周血血清，用于體外培養恒河猴視網膜血管內皮細胞系細胞(RF/6A)。分為糖尿病血清培養組(B組)、糖尿病+HIF-1反義寡核苷酸組(ASODN)(C組)、糖尿病+HIF-1正義寡核苷酸組(SODN)(D組)健康人血清培養細胞為正常對照組(A組)。使用免疫組織化學和免疫酶聯吸附法(ELISA)檢測HIF-1和ICAM-1的表達水平。結果： 在蛋白總量一致的情況下，A組細胞上清中sICAM-1的濃度為(13.89±1.35)ng/ml，而B組的濃度為(25.26±1.97)ng/ml ，HIF-1ASODN 轉染可以明顯降低細胞ICAM-1的表達水平，其濃度為(16.59±1.11)ng/ml，HIF-1SODN 轉染則不能影響細胞ICAM-1的表達。各組細胞之間ICAM-1表達水平比較有統計學差異(F=81.89，P=0.00)，各組之間兩兩比較，B組和D組之間比較無統計學差異(P=0.98)，其余各組之間兩兩比較有統計學差異(P均<0.05)。 結論 ：在體外培養條件下， HIF-1對糖尿病血清培養條件下的RF/6A細胞表達ICAM-1具有調節作用。

最新數據顯示：目前我國20歲以上的糖尿病患者約9240萬(人口的9.7%)，而14820萬成年人(15.5%)為糖尿病前期患者。我國已成為全球糖尿病患病人數最多的國家[1]。糖尿病視網膜病變(Diabetic retinopathy, DR)是糖尿病的重要并發癥，是成年人重要的致盲眼病。研究證明，髓樣細胞與視網膜血管內皮細胞的黏附是DR早期關鍵事件[2-3]，這個過程和血管內皮細胞表面細胞間粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1)的表達有關。細胞間粘附分子-1是促炎細胞因子，可介導白細胞的粘附和聚集，在免疫、炎癥等的形成過程中起重要作用[4]。缺氧誘導因子1是一種缺氧反應基因的中介因子，可傳導缺氧信號，激化一些與缺氧有關的基因，使細胞適應低氧環境，同時也可引起多種病理變化[5]。缺氧誘導因子1(Hypoxia-indacible factor-1 alpha,HIF-1)能調節DR病變狀態下髓樣細胞與血管內皮細胞粘附[6]，說明HIF-1有可能成為治療早期DR的重要靶點，但其是否可調節內皮細胞表面粘附分子ICAM-1尚不清楚。本研究通過體外細胞實驗方法，觀察在早期DR條件下，HIF-1對血管內皮細胞表面ICAM-1表達的調節，進一步明確HIF-1在DR治療中的作用機制,現報告如下。

材料和方法

1 材 料 人類血清來自2005年3月至9月在到西安市第四醫院眼科門診就診的10例1期DR患者及年齡和性別匹配的10例健康志愿者。每一位受試者實驗前均簽署知情同意書，并經西安市第四醫院醫學倫理委員會批準。DR分期按照國際臨床分類法。晨起抽取空腹血2ml, 離心5min, 取上清，用于細胞培養。

3 內皮細胞系細胞培養和分組 恒河猴視網膜脈絡膜血管內皮細胞系(RF/6A)購于中國科學院上海細胞生物所。以含有10%胎牛血清的RPMI1640培養液，在37℃的5%CO2孵箱中培養。待細胞生長至約70%融合狀態時，換成無血清的DMEM培養基，24h后A組加入10%健康人血清， B組加入10%DRP患者血清，C組在加入10%DR患者血清之前24h先轉染HIF-1反義寡核苷酸[梭華-SofastTM基因轉染試劑(廈門太陽馬生物工程公司)]D組在加入10%DRP患者血清之前24h先轉染HIF-1正義寡核苷酸，37℃ 的5%CO2孵箱中培養24h后收集細胞進行下一步實驗。每次實驗設3個復孔。共重復3次。

4 HIF-1α免疫組化 細胞爬片并固定，滴加鼠HIF-1α單克隆抗體(Chemicon公司)，濃度1∶500，37℃保溫30 min；滴加生物素化羊抗鼠IgG，37℃保溫30 min；滴加ABC復合劑，37℃保溫30 min；顯色，鏡下觀察，水洗中止反應；蘇木素輕度復染；系列酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固觀察。

5 ELISA 檢測RF/6A細胞培養中上清液中ICAM-1水平 人sICAM-1 ELISA試劑盒(上海森雄科技實業有限公司)，按照試劑盒說明，建立標準曲線后，將待測品孔每孔加入按一定比例稀釋的待測樣品100l，置37℃，120 min ；用洗滌液將反應板充分洗滌4～6次，在濾紙上印干；每孔加第一抗體工作液50l后置37℃，60 min后洗板；每孔加酶標抗體上作液100l后置37℃，60 min后洗板；每孔加底物上作液100l，置37℃暗處反應5～10 min；每孔加1滴終止液混勻。在酶標儀(美國BIO-RAD公司)上492 nm處測吸光度(OD值)；用Curve Expert1.3繪制標準曲線，根據曲線公式計算出ICAM-1的濃度。

6 統計學方法 采用SPSS 11.0統計學軟件。組間差異用單因素方差分析(ANOVA), 多組之間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD)。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 免疫組化染色結果 在正常人血清培養條件下，RF/6A細胞內即有少數陽性染色細胞出現，陽性部位主要在細胞核區，呈棕黃色染色。B組陽性染色細胞增多，陽性染色部位仍然位于胞核區。C組陽性細胞數量較A組減少。D組陽性細胞數量又增加，胞核內呈現深棕色染色(圖1)。

圖1 四組RF/6A細胞HIF-1免疫組化染色

2 ELISA檢測RF/6A細胞培養上清中ICAM-1水平 如圖2 ELISA 的標準曲線顯示。曲線公式為y=-0.17+55.53x+32.02x2，其中y 代表蛋白量，x代表OD值。

可是，在蛋白總量一致的情況下，A組細胞上清中sICAM-1濃度為(13.89±1.35 )ng/ml，而B組濃度為(25.26±1.97 )ng/ml ，HIF-1ASODN 轉染可以明顯降低細胞ICAM-1的表達水平，其濃度為(16.59±1.11 )ng/ml，HIF-1SODN 轉染則不能影響細胞ICAM-1的表達。各組細胞之間ICAM-1表達水平比較有統計學差異(F=81.89，P=0.00)，各組之間兩兩比較，B組和D組(25.28±1.02 )ng/ml之間無統計學差異(P=0.98)，其余各組之間兩兩比較差異有統計學意義(P均<0.05)。

圖2 ICAM-1的ELISA檢查標準曲線

討 論

本研究顯示，當用來自DR患者的血清培養后，血管內皮細胞ICAM-1水平顯著高于正常人血清培養下的水平。HIF-1蛋白表達被抑制后， ICAM-1表達水平相應下降，證明HIF-1對于ICAM-1的表達具有調節作用。 RF/6A細胞是研究視網膜血管內皮細胞病變的常用細胞系，文獻證明其具有人類視網膜血管內皮細胞的特征[8]。ICAM-1是CD18位于血管內皮細胞表面的配體，是白細胞與血管內皮細胞黏附的重要分子，是血管內皮細胞的激活的標志[9]。在糖尿病血清培養條件下細胞表達ICAM-1增多的原因和糖尿病代謝紊亂有關，循環血中的炎癥介質也是誘導ICAM-1 表達的重要因素。炎癥和血管內皮細胞功能障礙之間可能是雙向的關系，炎癥會加重血管內皮細胞功能障礙，而血管內皮細胞功能障礙之后ICAM-1表達可能會更高[10]。

HIF-1α是機體適應氧損傷的重要轉錄調節因子，缺氧是HIF-1α表達的經典刺激因素。但非缺氧因素也能刺激HIF-1α的表達，其中細胞因子是最重要的非缺氧調節因素[11]。 糖尿病血清培養后RF/6A細胞表達HIF-1α蛋白，可能和血清中這些細胞因子有關。本實驗結果顯示，在糖尿病狀態下，HIF-1α能調節血管內皮細胞表面ICAM-1的表達水平。已有研究顯示HIF-1α的表達與 VEGF呈正相關[12]，VEGF表達降低時，ICAM水平隨之降低。本實驗在使用反義寡核苷酸技術抑制了細胞HIF-1α表達后，糖尿病血清刺激誘導血管內皮細胞表面ICAM-1表達被抑制，HIF-1α可能通過直接和間接兩種途徑調節ICAM-1的表達。

本研究通過細胞實驗證實，在糖尿病血清培養條件下，HIF-1α具有調控ICAM-1表達的作用，它有可能成為治療早期DR的一個新的靶點。

[1] Yang SH, Dou KF, Song WJ. Prevalence of diabetes among men and women in China [J]. N Engl J Med，2010,362(25):2425-2426.

[2] Serra AM，Waddell J，Manivannan A，etal. CD11b+bone marrow-derived monocytes are the major leukocyte subset responsible for retinal capillary leukostasis in experimental diabetes in mouse and express high levels of CCR5 in the circulation [J]. Am J Pathol，2012，181:719-727.

[3] Li G，Veenstra AA，Talahalli RR，etal. Marrow-derived cells regulate the development of early diabetic retinopathy and tactile allodynia in mice [J]. Diabetes，2012，61:3294-3303.

[4] 楊徐杭，汶醫寧.冠心病中醫辨證與血清細胞間粘附分子-1的關系研究[J].陜西中醫，2008，29(2)：134-135.

[5] 秦 利，吳桂清，劉曉琴.妊娠期高血壓疾病胎盤滋養細胞中缺氧誘導因子的表達及意義[J].陜西醫學雜志，2013，42(7)：793-795.

[6] 宋虎平，朱 琦，吳 瓊.缺氧誘導因子1α特異性小干擾RNA對早期糖尿病大鼠視網膜白細胞黏附及髓樣細胞活性的影響[J].中華眼科雜志，2015，51(5)：241-245.

[7] 宋虎平，惠延年，雷春靈，等. 缺氧誘導因子1α對早期糖尿病視網膜病變狀態下人粒細胞系白血病細胞表面黏附分子CD18 表達的調節[J]. 中華眼底病雜志，2010，26:169-172.

[8] Gendron RL，Good wV，Adams LC，etal.Suppressed expression of tubedown-1 in retinal neovascularization of proliferative diabetic retinopathy[J]．Invest Ophthalmol Vis Sei， 2001，42：3000-3007.

[9] Gardner TW, Antonetti DA, Barber AJ,etal. Diabetic retinopathy: more than meets the eye [J]. Surv Ophthalmol, 2002, 47(Suppl 2): S253-S262.

[10] Van Hecke MV, Dekker JM, Nijpels G,etal. Inflammation and endothelial dysfunction are associated with retinopathy: the hoorn study [J]. Diabetologia, 2005, 48(7): 1300-1306.

[11] Richard DE, Berra E, Pouyssegur J. Nonhypoxic pathway mediates the induction of hypoxia-inducible factor 1alpha in vascular smooth muscle cells [J]. J Biol Chem, 2000, 275:26765-26771.

[12] 龐秋霞,米志寬,景彩霞,等.乳腺癌組織中 HIF-1α 及 VEGF-C 蛋白表達分析[J].陜西醫學雜志，2014，43(11):1448-1452.

(收稿：2016-12-05)

The mediation of HIF-1to the expression of ICAM-1 by RF/6A in diabetic condition

Tian Bingyu,Song Huping.

Department of Ophthalmology,Xi’an No.4 Hospital(Xi’an 710004)

Objective: To investigate the mediation of HIF-1to the expression of ICAM-1 by retinal vascular endothelial cell under early stage of diabetic retinopathy condition. Methods:The rhesus choroid-retina vascular endothelial cell line RF/6A were cultured in RPMI 1640 medium-10% human serum, which was collected from the subjects of early stage of diabetic retinopathy and age-matched healthy control. The cells were cultured in 4 groups as control group(group A),diabetic group (group B), HIF-1anti-sense oligonucleotides (ASODN) group (group C) and HIF-1sense oligonucleotides (SODN) group (group D). ICAM-1 levels in RF/6A supernatants were determined with ELISA kit. Results: Contrast to group A, the level of ICAM-1 significantly increased in group B (25.26±1.97) ng/ml vs (13.89±1.35 )ng/ml(P=0.00). But after HIF-1bioactivity was blocked (group C), the effect on the level of ICAM-1 by diabetic serum(group B) was suppressed significantly (25.26±1.97) ng/ml in group B(16.59±1.11) ng/ml in group C vs (25.26±1.97)ng/ml in group B(P=0.00). Conclusion: In vitro, HIF-1could regulate the expression of ICAM-1 by RF/6A. HIF-1may served as a therapeutic target for the treatment and/or prevention of early diabetic retinopathy.

Diabetic retinopathy/physiopathology Inflammation Hypoxia-inducible factor-1 alpha/analysis Intercellular adhesion molecule-1/analysis Endothelium,Vascular

*陜西省自然科學基金資助項目(2011JM4048)西安市科技發展計劃項目[SF1315(2)]

糖尿病視網膜病變/病理生理學 炎癥 缺氧誘導因子1，亞單位/分析 細胞間粘附分子/分析 內皮，血管

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.07.009

△通訊作者