牙本質非膠原蛋白對人根尖牙乳頭干細胞增殖及分化能力的影響

孟 琳，金 磊，劉 妍

大連大學附屬中山醫院口腔科 (大連 116001)

牙本質非膠原蛋白對人根尖牙乳頭干細胞增殖及分化能力的影響

孟 琳，金 磊，劉 妍

大連大學附屬中山醫院口腔科 (大連 116001)

目的：探討牙本質非膠原蛋白(DNCP)對人根尖牙乳頭干細胞(SCAP)的細胞增殖能力和分化能力的研究。方法：按照誘導液的不同，將81例實驗樣本分為兩組，DNCP組41例和血小板裂解液(PL)組40例，分離兩組樣本的人根尖牙乳頭，脂肪干細胞分離及培養采取酶消化法，以免疫組化技術對細胞進行鑒定，待樣本經誘導后，觀察兩組樣本在相差顯微鏡下的細胞形態改變，細胞增殖的測定采取MTT法，比較兩組SCAP的細胞增殖與分化的差異。結果：①DNCP組和PL組免疫指標CD44陽性率(依次為92.68%、92.50%)、CD105陽性率(95.12%、95.00%)及總陽性率(93.90%、93.75%)比較，均無統計學差異(P均>0.05)；②DNCP組在細胞核清晰數目(85.37%)、核仁數量在2個以上的比率(68.29%)及極性改變發生情況(82.93%)均顯著高于PL組(P均<0.05)；③DNCP組誘導后的OD值(0.379±0.204)明顯高于PL組(0.345±0.198) (P<0.05)。結論：DNCP對SCAP具有一定礦化能力，在SCAP中對增殖和分化可能存在一定促進作用。

近幾年，部分醫學專家在發育不完全的牙根尖內提取人根尖牙乳頭干細胞(Stem cellsfrom the apical papilla，SCAP)。Sonoyama等[1]以豬為動物模型進行實驗，通過磷酸三鈣、羥磷灰石的輔助作用，將SCAP植入豬下頜牙槽窩內，并于3個月后進行檢查，發現豬牙槽窩內生成了類似牙根的組織結構。雖然關于SCAP的研究眾多，但關于成牙本質細胞增殖與分化誘導液的研究卻較為有限。牙本質非膠原蛋白(Dentin non-collagenous protein，DNCP)主要成分為生長因子、牙本質特異性蛋白、蛋白多糖等，對上皮結構的增長具有一定促進意義[2-3]。而血小板裂解液(Platelet lysate，PL)為典型的血小板富集物之一，其不僅能夠降低免疫原性，自身還具有多種生長因子，可以為異體或異種移植提供有利條件[4]。基于此，本研究對DNCP與PL誘導SCAP的效果展開分析，現報告如下。

材料與方法

1 樣本選擇 選取81例人根尖牙乳頭組織樣本，納入及排除標準[5-6]：①均無系統性疾病；②無傳染性疾病者；③樣本資料完整，均符合實驗要求；④排除當月使用過抗生素者。本研究經我院醫學倫理委員會通過。將上述樣本按照實驗所用誘導液的區別，分為DNCP組41例和PL組40例，經比較，兩組基線信息比較無明顯統計學差異(P>0.05)，能夠匹配研究。

2 主要試劑和儀器 α-MEM培養基、胎牛血清、Collagenase酶Ⅰ型、Dispase酶(由美國Gibeo公司提供)、濃度為1%的PBS緩沖液(由德國hyclone公司提供)、透析袋(由美國光譜醫學公司提供)、鼠抗人STRO-1單克隆抗體、FITC標記的抗鼠抗體、S-ABC免疫組化試劑盒(均由美國SANTA CRUZ公司提供)、MTT細胞增殖試劑盒(由美國Trevigen公司提供)、0.4%臺盼藍染色劑(由上海哈靈生物科技公司提供)。TS100倒置相差顯微鏡(由日本NIKON公司提供)、全波長酶標儀(由美國熱電公司提供)、FACS Calibur流式細胞儀(由美國BD公司提供)、DMLB2HC圖像捕獲與測試系統(由美國LEICA公司提供)。

3 實驗方法

3.1 脂肪干細胞的分離與培養：將兩組樣本均以PBS液洗滌3次，兌入適量的Collagenase酶Ⅰ型(濃度為0.1%)，在5%CO2培養箱中消化30min，溫度控制在37℃左右。消化完畢，再以PBS液反復沖洗，以200目篩網過濾，制備成單細胞懸液。以1200r/min離心，5min后進行上清分離，連續清除2次。按照5×105/ml的密度將分離好的標本放置于無菌培養瓶中，之后放入培養箱中培養，待24h后進行PBS液沖洗，同時去除未貼壁的細胞，在細胞貼壁率達到80%時，以Dispase酶進行傳代。

3.2 脂肪干細胞鑒定：在Dispase酶成功傳代后，將其制備成細胞懸液。按照單孔5×104個細胞的密度接種于6孔板蓋玻片上，并放置于5%CO2培養箱內消化，溫度應調控在37℃，直到細胞貼壁后，再以PBS液清洗3次，放置30min后，按照濃度為CD441∶50、CD1051∶500的一抗實施免疫組化染色。

3.3 DNCP與PL的制備：①DNCP的制備：將人根尖牙乳頭組織樣本去髓，磨去釉質與牙骨質，搗成粉末，取500μg，溶解于EDTA溶液中，在4℃環境中浸泡2d，直至全部溶解，再將其倒入45 ml α-MEM培養基中(含胎牛血清20ml/L)，之后將上清液保存在透析袋中，之后倒入燒杯中，加雙蒸水透析，并分裝于離心管內，真空干燥，收集DNCP備用。②PL的制備：采集新鮮ACD-A抗凝血小板，將其混勻，并通過生理鹽水制備成懸液，清除血漿，要求血小板達到1×109/ml 以上的濃度，再將樣本反復凍融3次，溫度設置為-80℃和37℃，時間間隔掌控在12h左右。取900g凍融裂解產物進行分離上清處理，將分離后的血小板裂解液以0.22μm濾器過濾，分裝后放在-80℃的環境保存，使用前再以37℃水浴融解。

3.4 誘導液作用脂肪干細胞后的增殖情況：將生長對數期的干細胞樣本制備成懸液，按照4.5×106/ml 接種于96孔板，置入培養箱，取出以PBS液沖洗，待細胞貼壁后，將其分為兩組：DNCP組與PL組。兩組均加入等量培養液，各100μl，并各自培養3d。在培養結束前4h各孔分別加入0.5%MTT液20μl，培養完畢后，用無菌針頭吸去液體，再各自加入150μl DMSO結晶，以S-ABC免疫組化試劑盒檢測各孔OD值，重復操作3次，以平均值計算。

4 觀察指標 比較兩組免疫染色CD44、CD105陽性率，觀察細胞形態，于使用誘導液前及使用誘導液培養3d后比較兩組細胞增殖情況的改變。

結 果

1 兩組免疫組化染色結果的比較 兩組免疫指標CD44、CD105陽性率及總陽性率比較，均無統計學差異(P均>0.05)，見表1。

表1 組間免疫組化染色結果的比較[例(%)]

2 兩組細胞形態的比較 DNCP組與PL組在細胞核是否清晰、核仁數量及有無極性改變方面比較，均有統計學差異(P均<0.05)，見表2。

3 兩組細胞增殖情況的比較 DNCP組和PL組在誘導后的OD值均明顯上升(P均<0.05)，DNCP組上升更為顯著(P<0.05)，見表3。

表2 組間細胞形態的比較[例(%)]

表3 組間細胞增殖情況的比較

討 論

牙根發育與再生具有復雜的調控機制，是一個多因素參與的過程。在牙齒發育中，牙囊細胞發揮著重要作用，其需經牙斷裂的上皮根鞘，與SCAP和前期牙本質長時間密切接觸，產生相互作用，只有在這種條件下，牙根組織才能實現再生的可能[7-8]。血小板富集物在干細胞增殖、修復和再生方面的作用已被多個文獻報道[9-10]，而PL為血小板富集物的一種，是其裂解后的產物，相比血小板富集物而言，其具有更好的免疫原性，富含轉化生長因子、血小板衍生因子、上表皮生長因素及正常T淋巴細胞表達等多種液態生長因子，這些因子對骨改建的再生與修復作用已被證實。DNCP是從發育期牙本質中取得的間充質干細胞，經科學研究發現，DNCP富含骨成型蛋白質、胰島素樣生長因子、6-甲基尿嘧啶與轉化生長因子等多種具有向成牙本質細胞分化作用的因子，對激發牙髓活力，使患牙重新生成牙髓具有較好的促進作用。雖然二者對于牙周組織的改建作用均被證實[11]，但二者在SCAP細胞增殖與分化能力方面的研究仍欠缺完善。基于此，本實驗選取基礎信息較為匹配的兩組進行誘導液實驗。研究表明，DNCP組和PL組在免疫指標CD44陽性表達率、CD105陽性表達率方面比較無統計學差異(P均<0.05)，但二者在細胞分化方面，DNCP誘導液在細胞核清晰程度、核仁數量、極性變化等方面均具有顯著優勢(P均<0.05)，同時，細胞增殖實驗表明，DNCP OD值(0.379±0.204)顯著高于PL組(0.345±0.198) (P均<0.05)，可見DNCP的增殖與分化能力較PL更具優勢，可能與其獨有的成分有關，其中骨成型蛋白質具有促進祖細胞和成骨細胞分化，誘導非骨組織來源分化，刺激膠原的合成，增強堿性磷酸酶的活性有關。胰島素樣生長因子是一種結構和功能都與胰島素類似的多肽類神經營養因子[12]，主要由肝細胞分泌，部分來自組織的自分泌或旁分泌[13]。胰島素樣生長因子在軟骨細胞增殖方面與軟骨基質合成方面具有良好作用，可以刺激II型膠原蛋白合成，對磷酸酯酶和糖胺聚酶的活性增強具有顯著作用，在促進細胞分化成熟具有顯著功效。除此，轉化生長因子、6-甲基尿嘧啶均參與牙周組織的改建，這使DNCP在SCAP增殖與分化中發揮良好作用。

綜上所述，DNCP在SCAP中對增殖和分化發揮了較好的誘導作用，對SCAP的細胞改建有積極意義，伴隨生物醫學高速發展，牙根發育與再生技術還可得到進一步完善。

[1] 蔣玉姣,曹 靈,俞 艷,等.牙本質非膠原蛋白對人牙髓干細胞增殖活性及礦化能力的影響[J].口腔生物醫學,2013,4(1):15-18.

[2] 劉晨晨,雷 港,俞 艷,等.牙本質非膠原蛋白對大鼠骨髓間充質干細胞增殖活性和礦化能力的影響[J].牙體牙髓牙周病學雜志,2010,20(5):255-259.

[3] 馬兆峰,李 石,翁希里,等.牙本質非膠原蛋白對人根尖牙乳頭干細胞增殖及分化能力的影響[J].牙體牙髓牙周病學雜志,2016,26(5):283-287.

[4] 吳娟娟,田 芳,宋 琦,等.2種不同成牙本質誘導液對大鼠脂肪干細胞增殖凋亡的影響[J].重慶醫學,2015,44(7):881-884.

[5] 白 玉,陳 博,王捍國,等.血小板裂解液對人根尖牙乳頭干細胞和牙周膜干細胞體內外增殖、礦化能力的影響[J].牙體牙髓牙周病學雜志,2012,22(8):433-439.

[6] 謝麗麗,周 惠,史 冊,等.牙骨質非膠原蛋白對乳牙牙髓干細胞影響的實驗研究[J].現代口腔醫學雜志,2014(2):99-102.

[7] 于 莉,李淑慧,周春梅,等.根尖乳頭干細胞向牙髓牙本質復合體分化能力的實驗研究[J].臨床口腔醫學雜志,2016,32(1):26-29.

[8] 張 羽,吳家媛.生長因子對根尖牙乳頭干細胞增殖及分化的影響[J].中國實用口腔科雜志,2016,9(3):187-190.

[9] 閆 明,曹 靈,俞 艷,等.肝細胞生長因子對根尖牙乳頭干細胞增殖和礦化能力的影響[J].口腔生物醫學,2011,2(3):136-139.

[10] 趙 璐,吳佩玲,于 莉,等.TNF-α對根尖乳頭干細胞與牙周膜干細胞增殖活性影響的比較研究[J].中國美容醫學雜志,2016,25(1):34-37.

[11] 趙 璐,于 莉,袁 萍,等.根尖乳頭干細胞與牙周膜干細胞的生物學行為比較[J].中國組織工程研究,2016,20(1):113-117.

[12] 劉曉利，吳玉梅.復方靈芝健腎湯對早期糖尿病腎病患者尿液AGT及IGT-1的影響[J].陜西中醫，2016，37(3)：281-283.

[13] 顧 堅，李 松，顧數偉，等.胰島素水平生長因子-1對小鼠病毒性心肌炎心肌細胞凋亡蛋白p53的表達的影響[J].陜西醫學雜志，2013，42(1)：11-12，53.

(收稿：2016-11-30)

牙本質 細胞增殖 細胞分化 尖牙 干細胞

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.07.011