應用Carba NP方法檢測耐碳青霉烯類抗生素鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌

邱萬臣，楊 靖，時東彥*，范士英(.河北省清河縣人民醫院檢驗科，河北 邢臺 054000；.河北醫科大學第二醫院檢驗科，河北 石家莊 050000)

·論 著·

應用Carba NP方法檢測耐碳青霉烯類抗生素鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌

邱萬臣1，楊 靖2，時東彥2*，范士英2
(1.河北省清河縣人民醫院檢驗科，河北 邢臺 054000；2.河北醫科大學第二醫院檢驗科，河北 石家莊 050000)

目的應用Carba NP方法檢測耐碳青霉烯類抗生素鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌產生的碳青霉烯酶。方法收集30株耐碳青霉烯類抗生素鮑曼不動桿菌和10株耐碳青霉烯類抗生素銅綠假單胞菌，應用全自動細菌鑒定儀進行菌株鑒定和藥物敏感試驗，應用Carba NP方法檢測碳青霉烯酶。結果30株鮑曼不動桿菌中，Carba NP試驗結果陽性23株，陽性率為76.7%。10株銅綠假單胞菌中，Carba NP試驗結果陽性8株,陽性率為80.0%。結論Carba NP方法操作簡單，試劑成本低，易于在實驗室開展，可快速檢測耐碳青霉烯類抗生素細菌的產酶情況。

鮑氏不動桿菌；銅綠假單胞菌；碳青霉烯酶

鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌屬于非發酵革蘭陰性桿菌，是醫院內重要的機會致病菌，尤其在免疫力低下的患者中，可以引起嚴重的甚至致死性的感染，如敗血癥、呼吸機相關肺炎、泌尿系統感染、腦膜炎等。近年來碳青霉烯類藥物耐藥的鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌檢出率呈上升趨勢，尤其碳青霉烯類抗生素耐藥鮑曼不動桿菌的檢出率上升最為明顯。碳青霉烯類抗生素一直是作為治療革蘭陰性桿菌的最后防線，但如此高的耐藥率導致目前出現了無藥可選的局面，故盡快尋找產生這種耐藥的機制，成為當前研究的熱點。本研究應用Carba NP方法檢測耐碳青霉烯類抗生素的鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌，旨在及早報告臨床，從而為臨床選擇合適抗生素、減少醫療消耗、減少耐藥株傳播提供有效服務。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 選擇從河北省清河縣人民醫院和

河北醫科大學第二醫院臨床標本分離所得的耐碳青霉烯類抗生素的鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌共計40株，全部菌株均采用全自動細菌鑒定藥物敏感鑒定儀進行驗證。菌株采用無菌紙片-20 ℃低溫保存。選取肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705碳青霉烯酶陽性對照質控菌株，肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706碳青霉烯酶陰性對照質控菌株，藥物敏感質控菌株大腸埃希菌ATCC 25922。

1.2 藥物敏感試劑 藥物敏感試驗平板(鄭州安圖生物工程股份有限公司)，亞胺培南和美洛培南紙片(北京天壇試劑公司)，亞安培南西司他丁(默沙東制藥公司)

1.3 藥物敏感試驗方法 統一采用美洛培南和亞安培南紙片法檢測耐碳青霉烯類抗生素耐藥的菌株，依據美國臨床與實驗室標準化協會2015年判斷標準[1]，見表1。

表1 美洛培南和亞安培南對鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌的判斷標準

1.4 Carba NP檢測液的配制[2]A液：準備25～50 mL容器，加入2 mL 0.5%酚紅溶液于16.6 mL蒸餾水中，然后加入180 μL 10 mmol/L ZnSO4溶液。用0.1 N NaOH或者10%HCl調節pH值為7.8±0.1。4～8 ℃保存1個星期，避免長時間光照。B液：檢測液A中加入12 g/L亞胺培南西司他丁鈉。計算B液需要量，平均1株菌需要100 μL B液。共配制15 mL A液，加入180 mg亞胺培南西司他丁備用。加完后不用再調pH值。4～8 ℃保存3 d，一般現配現用。

1.5 Carba NP方法 分別設置A、B兩管。每管中加入100 μL 5 mol/L NaCl。用10 μL接種環挑取滿環經過過夜培養的菌落加入到A、B兩管100 μL 5 mol/L NaCl溶液中，肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705碳青霉烯酶陽性對照質控菌株和肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706碳青霉烯酶陰性對照質控菌株也分別加入到A、B兩管100μL 5 mol/L NaCl溶液中，蓋上蓋子，渦旋振蕩混勻。在標記的A、B管中，分別對應加入100μL A、B檢測液，蓋上蓋子，振蕩混勻。放入35 ℃溫箱中2 h后觀察結果。

1.6 結果解釋 依據美國臨床與實驗室標準化協會2016年標準[3]進行結果解釋，見表2。

表2 Carba NP對于懷疑產碳青霉烯酶細菌試驗結果的解釋

2 結 果

2.1 藥物敏感試驗結果 統一采用美洛培南和亞安培南紙片法檢測耐碳青霉烯類抗生素耐藥的菌株，2種抗生素任意1種耐藥即可判定為碳青霉烯類抗生素耐藥的菌株，經過篩選共收集耐碳青霉烯類抗生素的鮑曼不動桿菌30株，耐碳青霉烯類抗生素的銅綠假單胞菌10株。

2.2 Carba NP檢測結果分析 30株鮑曼不動桿菌中Carba NP試驗結果陽性23株，陽性率為76.7%；10株銅綠假單胞菌中Carba NP試驗結果陽性8株，陽性率為80%(圖1)。

圖1 Carba NP 試驗結果

25，26，27：檢測菌株；1705：陽性對照；1706：陰性對照

3 討 論

近年來，由于廣譜抗生素的廣泛和不合理應用，導致銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌對多種抗生素出現了獲得性耐藥，并導致了多重耐藥甚至泛耐藥菌株。而碳青霉烯類藥物具有抗菌譜廣、抗菌活性強，同時能有效抑制幾乎所有革蘭陰性細菌生長的特性，成為臨床上治療多重耐藥菌感染的常用抗菌藥物。但隨著其臨床應用的日益廣泛，耐碳青霉烯銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌逐漸增多，還有天然耐碳青霉烯類的細菌逐漸增多，如嗜麥芽窄食單胞菌，給臨床感染的預防與治療帶來了極大的困難。近幾年有關耐碳青霉烯類抗生細菌的報道越來越受到重視，無論從國家耐藥監測網到省級耐藥監測網還是醫院內部都有此類菌的報道，耐碳青霉烯類抗生素的鮑曼不動桿菌有逐年上升的趨勢，而耐碳青霉烯類抗生素的銅綠假單胞菌耐藥率變化不大。2012、2013年河北省細菌耐藥性監測網報道銅綠假單胞菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為35.0%和39.2%，而鮑曼不動桿菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為70.9%和78.2%[4-5]。耐亞安培南的銅綠假單胞菌為33.0%，耐美洛培南的銅綠假單胞菌為33.4%[6-8]。2015年CHINET監測網報道耐亞安培南的銅綠假單胞菌為27.6%，耐美洛培南的銅綠假單胞菌為23.4%，耐亞安培南的鮑曼不動桿菌為62.0%，耐美洛培南的鮑曼不動桿菌為70.5%[9-10]。

細菌對碳青霉烯類抗生素產生耐藥的主要耐藥機制有：①碳青霉烯酶產生;②外膜蛋白改變導致外膜通透性的減少;③外排泵的高度表達;④青霉素結合蛋白靶位的改變，青霉素結合蛋白靶位改變主要見于革蘭陽性球菌，在革蘭陰性桿菌中較少見。碳青霉烯酶的產生一直被認為是最常見的，碳青霉烯酶是一類能夠水解亞胺培南或者美羅培南等碳青霉烯類的一類β內酰胺酶[11]。包括Ambler分類中的A、B、D三類酶。有重要臨床意義的是質粒介導的碳青霉烯酶基因型，主要包括亞胺培南銅綠假單胞菌酶(imipenemase, IMP)、亞胺培南酶(verona Imipenemase,VIM)、苯唑西林酶(oxacillinases,OXA)、產碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia carbapenemase,KPC)和新德里一號金屬酶(New Delhi metalloid β-lactamase 1,NDM-1), D類碳青霉烯酶的水解作用是鮑曼不動桿菌耐碳青霉烯類的最主要原因,這類酶的基因位于質粒和染色體上，OXA-23、OXA-24和OXA-58在鮑曼不動桿菌中發現的較多[12]，IMP和VIM在銅綠假單胞菌中常見[13]。

Carba NP方法[14]是2015年美國臨床與實驗室標準化協會推薦的碳青霉烯酶的生化檢測法。主要原理是測試菌水解亞胺培南的β內酰胺環，通過pH指示劑的顏色變化(通常是用酚紅指示劑，顏色由紅色變為黃色或橘黃色)判斷細菌的產酶情況。美國臨床與實驗室標準化協會推薦這種試驗適用于腸桿菌和銅綠假單胞菌，而不動桿菌屬產生了大量弱的D類碳青霉烯酶，傳統的Carba NP很難檢測出在不動桿菌屬中高表達的OXA型的D類碳青霉烯酶。因此，建立一個改良的Carba NP(CarbAcineto NP)方法[15]用于檢測不動桿菌的碳青霉烯酶。在Carba NP試驗中，大量的蛋白抽提液會阻礙弱的碳青霉烯酶活性的釋放。而在CarbAcineto NP中，用高滲的5 mol/L NaCl取代了蛋白抽提液，可以使細菌完全溶解，釋放蛋白，并且挑取的菌量也增加了2倍，可以增加酶的釋放量，故可以更好地檢測鮑曼不動桿菌產酶情況。目前Carba NP試驗用于檢測腸桿菌科細菌的產酶情況研究較多，國外已經有了報道[16]，但是國內報道較少，對于鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌的產酶檢測報道更少，因為收集菌株麻煩，且產酶量相對較低。因此，本研究選擇了臨床上耐藥率較高的2種細菌，篩選耐藥性較高的菌株進行研究，以期能使得此方法盡快得到認可和應用。30株耐碳青霉烯類的鮑曼不動桿菌中Carba NP試驗結果陽性23株。大量基因研究表明鮑曼不動桿菌產OXA-23類基因的碳青霉烯酶是鮑曼不動桿菌耐碳青霉類抗生素的主要耐藥機制[17]，故產碳青霉烯酶也是鮑曼不動桿菌最主要的耐藥機制，通過Carba NP方法檢測雖然不知道具體產酶的類型，但是可以檢測產酶的結果。Carba NP方法使用的試劑廉價，操作簡單，用時短，結果易于解釋，在普通實驗室就可以開展，可以為臨床及時應用及調整抗生素提供快速有效的依據。

目前已經公認的碳青霉烯酶表型檢測方法為HODGE試驗，這個方法對檢測A類和D類碳青霉烯酶有很高的敏感度，包括檢測具有弱碳青霉烯酶活性的OXA23、GES-5，但是對于產金屬酶的敏感度較低。Girlich等[18]研究了對碳青霉烯類耐藥的腸桿菌，檢測產NDM的敏感度只有50%。這可能是由于細菌釋放細菌素肽，干擾指示菌的生長，影響結果。由于金屬酶MBL的活性依賴Zn2+，研究者們往MH藥物敏感瓊脂中添加硫酸鋅(100 mg/L)，使敏感度提高到了85.7%。經過長期實驗證明，由于不同種類碳青霉烯酶對藥物的水解作用有差異,另外如果菌株產CTX-M型ESBLs或高于亞胺培南和美羅培南AmpC酶并且伴有外膜蛋白表達減少或缺失可引起假陽性。由于此方法對于金屬酶檢測不到，對于過度表達的頭孢菌素酶可以導致假陽性，故此類方法目前在臨床中僅推薦用于腸桿菌科細菌的檢測，不能用于檢測鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌，其他的表型檢測方法復雜，敏感度不高，故未被廣泛應用。PCR是碳青霉烯酶基因檢測的“金標準”，可以精確鑒定碳青霉烯酶的種類。目前直接進行碳青霉烯酶基因檢測的技術有普通PCR、實時熒光定量PCR、多重PCR、環介導等溫擴增、基因芯片等。PCR 缺點是成本較高，需要較高的專業技能，只能檢測已經確定的基因。PCR方法[19]可以精確鑒定碳青霉烯酶的種類，但是實驗過程復雜，試劑消耗高，需要專門的儀器，并且只能鑒定已知的碳青霉烯酶基因，在普通實驗室很難開展。由于目前碳青霉烯類抗生素耐藥菌株分離率越來越高，故迫切需要一種簡便快速的方法應用于臨床，2015年美國臨床與實驗室標準化協會推薦了Carba NP方法。此方法雖然檢測的菌株和酶的種類增加了，但是操作仍然復雜，需要試劑種類繁多，操作需要專業人員。因此，仍需開發更適用、更簡便、更可靠的方法。

隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛使用，細菌耐藥性逐漸增加，耐碳青霉烯類抗生素的鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌明顯增加。這些耐藥菌株造成醫院感染的暴發流行，給臨床治療帶來了嚴峻挑戰，病死率高，無藥可用。耐碳青霉烯銅綠假單胞菌已成為全球關注的重大問題，應加強對碳青霉烯類耐藥的細菌動態監測，密切關注其耐藥的發生與發展，探討其耐藥機制，尋找快速檢測方法，從而有效延緩其耐藥性的進展。

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(本文編輯：趙麗潔)

2016-12-27；

2017-02-19

邱萬臣(1981-)，男，河北清河人，河北省清河縣人民醫院主管技師，醫學學士，從事臨床檢驗學研究。

*通訊作者。E-mail：shidongyan73@126.com

R446.1

B

1007-3205(2017)07-0847-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.07.027