野雉尾金粉蕨微繁殖技術

2017-07-31 15:51:00陳嘉裔

浙江農業科學 2017年6期

管菊，萬勁，陳嘉裔

(1.西南林業大學園林學院，云南昆明 650224； 2.三江學院，江蘇南京 210012； 3.昆明綠島園藝有限公司，云南昆明 650224)

野雉尾金粉蕨微繁殖技術

管菊1，萬勁2，陳嘉裔3*

(1.西南林業大學園林學院，云南昆明 650224； 2.三江學院，江蘇南京 210012； 3.昆明綠島園藝有限公司，云南昆明 650224)

以野雉尾金粉蕨的孢子為外植體，建立快繁體系。結果表明，野雉尾金粉蕨孢子HgCl2最佳處理時間為3 min，孢子最適萌發培養基為1/2MS+2%蔗糖。增殖期間，降低糖濃度更有利于配子體的快速增殖，最適增殖培養基為1/2MS+1%蔗糖。1/2MS+2%蔗糖為最適孢子體誘導培養基，待幼孢子體長至3～5 cm時，即可出瓶煉苗，煉苗最優基質為草炭+蛭石(1∶1)。

野雉尾金粉蕨；孢子；微繁殖

野雉尾金粉蕨(Onychiumjaponicum)，又名中華金粉蕨、柏香蓮，為中國蕨科金粉蕨屬植物，常生于海拔50～2 200 m的林下溝邊或灌叢陰處，主要分布于秦嶺以南、廣東以北地區，云南產綏江、大關、宣威等地[1]。野雉尾金粉蕨生長旺盛，葉密呈叢狀，似雞尾形，造型別致，優雅飄逸，極適宜于盆栽或垂吊栽培觀賞。

試驗采用微繁殖技術建立其快繁體系，將對保護野雉尾金粉蕨野生資源不受破壞、合理進行開發利用有著重要意義，同時也對促進可持續發展、保持生物多樣性及維護生態平衡具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料

野雉尾金粉蕨孢子采自云南省昆明市金殿蕨類植物園，采集日期2015年10月，采集后放置于4 ℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 培養條件

本試驗培養基以MS、1/2MS為基本成分，分別附加0.4%的1 500 g·cm-2強度卡拉膠以及不同濃度的蔗糖，調整pH值在5.8～6.0，于121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌15 min。使用日本三洋MLR-351H型人工可控氣候箱進行培養，光照強度設定為3 000 lx，每日光照時長18 h，培養溫度恒定25 ℃，培養濕度恒定80%。

1.2.2 孢子預處理

為使孢子滅菌取得更好效果，首先對孢子進行預處理，使孢子被水充分浸潤，并進一步去雜。

稱取1 mg供試孢子，置于5 mL離心管內，滴入無菌水，充分振蕩后以3 000 r·min-1離心1 min，棄去上清液，重復2次，至上清液無肉眼可見雜質后，再次充分振蕩，得到的即純度較高的孢子懸濁液，備用。

1.2.3 孢子滅菌

使用一次性無菌滴管吸取1 mL孢子懸濁液，滴入濾紙疊成的紙包內，置于75%的酒精中浸泡約15 s，無菌蒸餾水清洗2次，再用0.1%的HgCl2(使用前添加1～2滴吐溫-80)浸泡滅菌，設置30 s及1、3、5 min不同時長的滅菌處理組。浸泡滅菌后，用無菌水清洗5～6次，清洗總時長不少于5 min，然后用滴管吸取濾紙袋內的孢子懸濁液，滴于1/2MS+1%蔗糖培養基中，輕輕搖晃，使懸浮液均勻分布于培養基上。試驗每個處理接種6瓶，重復4次。接種后每日取樣，使用顯微鏡對孢子萌發進行鏡檢，使用Nikon ECLIPSE Ti倒置顯微鏡進行拍照記錄，5 d后對污染率進行調查，20 d后統計孢子萌發率。

孢子萌發率檢測方法為隨機鏡檢，隨機抽取處理組中4瓶，以100倍的放大倍數，在每瓶內隨機選擇4個視野進行觀察，對視野內孢子進行萌發率統計，以出現綠色配子體細胞作為萌發標準。

1.2.4 孢子萌發培養

將孢子懸濁液按先前得出的最適滅菌方法進行處理，處理后分別接種于不同成分的培養基中，培養條件同上，每處理20瓶，重復3次。接種7 d后，每隔2 d觀察和記錄配子體的生長發育狀況，30 d后結束調查。

1.2.5 增殖培養

將原葉體充分分散成單個個體，挑選出其中長勢良好、大小相近的原葉體個體，分別接種于不同培養基中進行增殖培養。使用不同培養基成分(A)、不同蔗糖含量(B)、不同pH值(C)的組合對原葉體進行增殖培養，試驗采用L9(34)的正交試驗設計，1～3水平因素A分別為MS、1/2MS和1/4MS，B分別為1%、2%和3%，C分別為5.8、6.0和6.2。處理組合為A1B1C1、A1B2C2、A1B3C3、A2B1C2、A2B2C3、A2B3C1、A3B1C3、A3B2C1和A3B3C2。

每瓶培養基接原葉體10棵，每種培養基接20瓶，重復3次，為方便數據統計，在接種時原葉體個體之間均需保留一定距離，均勻分布于培養基上。接種7 d后開始觀察并記錄生長狀況，觀察記錄原葉體長勢、增殖狀況，60 d后對原葉體長勢、增殖倍數進行統計分析。

1.2.6 幼孢子體誘導

將長勢良好、大小相近的原葉體個體分別接入以下孢子體誘導培養基中。①1/2MS；②1/2MS+1%蔗糖；③1/2MS+2%蔗糖；④1/2MS+3%蔗糖。試驗每組接種15瓶，重復3次。7 d后，每隔2 d觀察并記錄生長狀況，不再轉接，60 d后對誘導率進行統計。

1.2.7 煉苗與移栽

當幼孢子體長至3～5 cm時進行馴化移栽。首先在培養室半開瓶蓋放置3 d，然后用鑷子從瓶內取出植株，用自來水沖洗凈附著在根部的培養基，移栽到不同基質的穴盤中。1號草炭，2號蛭石，3號草炭+蛭石(1∶1)。置于光照培養箱中培養，設定培養溫度25 ℃，光照12 h，濕度90%。45 d后，對根長、苗高、狀態等進行統計。

2 結果與分析

2.1 不同滅菌時間對外植體成活率的影響

由表1可知，隨著HgCl2滅菌時間的增加，污染率大幅降低，說明HgCl2對于孢子表面所攜帶的污染物具有較好的滅殺效果。但隨著滅菌時間的延長，孢子的萌發活性也會受到影響。結果表明，75%的酒精處理15 s后，再用0.1% HgCl2處理3 min，為野雉尾金粉蕨孢子的最佳滅菌方法。

表1 不同滅菌處理對野雉尾金粉蕨孢子成活率的影響

2.2 不同濃度無機鹽及糖對孢子萌發及原葉體形成的影響

接種4 d后于顯微鏡下即可觀察到孢子大量萌發，萌發后逐漸形成絲狀體和片狀體，30 d后可形成直徑0.2 cm左右的綠色原葉體。經相關性分析可得，萌發率與MS鹽濃度相關系數為-0.998，萌發率與蔗糖濃度的相關系數為-0.016，萌發率與MS鹽濃度在0.01水平上極顯著相關，說明在本試驗梯度下，野雉尾金粉蕨孢子萌發情況主要只與無機鹽濃度高低有關，而與糖濃度基本無關，較低的無機鹽水平有利于孢子的萌發，1/2MS培養基為孢子萌發最適培養基。由表2可知，野雉尾金粉蕨孢子萌發后，糖濃度與無機鹽濃度均對其生長均有一定影響，萌發后的孢子在不加糖的培養基上生長速度極為緩慢，綠色絨狀體最小，較低的無機鹽水平以及一定的糖濃度更有利于孢子萌發后的生長，6號1/2MS+2%蔗糖培養基最適于孢子萌發生長。

表2 不同培養基下野雉尾金粉蕨孢子萌發情況

注：+號代表配子體生長量，數量越多表示生長量越大。

2.3 不同濃度無機鹽、糖及pH對原葉體增殖的影響

在原葉體增殖階段，低鹽分、低濃度蔗糖更加適宜原葉體的增殖生長。原葉體在高糖環境下，雖然增殖倍數也較高，但自身體積變小，且出現團塊狀生長、相互之間無法分離，這對于今后原葉體的轉接擴增、幼孢子體的形成都極為不利。

由表3可知，1/2MS+1%蔗糖的4號培養基為原葉體增殖最適培養基，在該配方下，原葉體無性增殖數量多，且原葉體個體形態較大、相互間質地疏松可分開，有利于原葉體的轉接擴增以及幼孢子體的誘導。培養基MS鹽濃度與增殖倍數呈顯著相關(F=726.500，P=0.001)，說明主要影響增殖情況的仍為培養基MS鹽濃度，而當pH值處于5.8～6.2時，對增殖培養幾乎沒有影響。

表3 不同成分培養基處理組合下野雉尾金粉蕨原葉體增殖生長情況

2.4 孢子體誘導

不同糖濃度下孢子體誘導的具體情況見表4。原葉體停止轉接后，不加糖配方的培養基沒有誘導出孢子體，且原葉體生長極為緩慢，出現了部分死亡的現象。高糖濃度配方的培養基上，原葉體不斷增殖繼續團塊狀生長，同樣沒有誘導出孢子體。1%、2%糖濃度培養基在停止轉接后約40 d即有孢子體產生，60 d后統計孢子體生長情況，1%蔗糖濃度培養基相比2%蔗糖濃度培養基孢子體產生數量少、長勢弱、葉片發黃。由此可見，1/2MS+2%蔗糖培養基為孢子體誘導適宜培養基。

2.5 煉苗與移栽

45 d后煉苗及移栽情況見表5、圖1。由于蕨類在煉苗時孢子體已有根系長出，植株具備完整的根、莖、葉結構，煉苗成活率很高，期間注意噴水、遮蔭和保溫即可。在以蛭石為基質的煉苗盤中，由于蛭石養分含量較少，故幾乎沒有生長量，新生葉萌發數量少、植株細長瘦弱。在泥炭基質中的苗新葉數量、根系數量、苗高、長勢等均沒有在草炭+蛭石(1∶1)的混合栽培介質中的好，這可能是由于添加蛭石后，介質的透氣性得到改善，從而更有利于植株根系的生長，促進了植物的營養吸收。

表4 60 d后不同糖濃度下孢子體誘導情況

注：+數量代表誘導數量多少。

表5 野雉尾金粉蕨的煉苗與移栽

注：表中數值為平均值±標準差；不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著；+代表植株長勢情況。

圖1 野雉尾金粉蕨配子體增殖、孢子體誘導、煉苗移栽情況

3 討論

本試驗以野雉尾金粉蕨的孢子作為外植體，經滅菌處理后建立其無菌繁殖體系，理論上可以無限數量增殖生長，避免常規孢子繁殖中孢子材料有限[2]的問題；在配子體增殖階段，于適宜的培養配方、培養環境下，其增殖量每60 d可達20.27倍，與常規孢子繁殖研究相比，大大提高了繁殖效率；煉苗移栽環節中，煉苗方法簡單、栽培基質配方易于調配，45 d左右即可正常養護，以上這些都使得短時間內獲得標準化野雉尾金粉蕨種苗成為可能，這對于開發利用野雉尾金粉蕨資源具有重要意義。

在試驗過程中還發現，野雉尾金粉蕨微繁殖各階段中，1/2MS培養基培養效果較MS培養基效果均更好，這說明野雉尾金粉蕨適合于較低無機鹽濃度的培養基上生長，這一現象與吳芹等[3-4]研究觀點基本一致，說明蕨類的微繁殖可能都需要較低的無機鹽水平。在孢子體誘導階段，據文獻報道及前期試驗發現，不同蕨類在離體培養微繁殖過程中，幼孢子體的產生的狀況差異很大。如本試驗中的野雉尾金粉蕨，即屬于配子體可增殖、孢子體可瓶內誘導的蕨類，由于其配子體增殖倍率已經很高，故試驗過程中沒有再誘導愈傷的必要，快繁可直接通過增殖配子體產生孢子體來實現。而對于部分配子體難以快速增殖[5]、孢子體難以瓶內發生[6]及無法獲得孢子材料[7]的這類蕨類，為提高增殖倍數，就需通過調整培養基配方來進行，如通過誘導愈傷、誘導GGB、誘導產生叢生芽等途徑來實現植株的高速增殖。

本試驗只針對糖濃度以及培養基成分對于生長的影響進行了初步研究，而韋景楓等[8]在研究鳳丫蕨微繁殖時發現，通過添加NAA、BA等外源激素于培養基內可以有效提高增殖倍數，野雉尾金粉蕨微繁殖過程中是否也存在這一現象，在添加不同濃度激素、不同激素組合下是否還可以繼續提高配子體增殖倍數、孢子體誘導率等，這些有待做進一步深入研究。

[1] 中國科學院昆明植物研究所. 云南植物志第20卷：蕨類植物[M]. 北京：科學出版社，2006.

[2] 孫起夢，劉興劍. 幾種蕨類植物的孢子繁殖試驗研究[J]. 安徽農業科學，2010，38(25)：13571-13572.

[3] 吳芹. 幾種觀賞蕨類植物的繁殖技術研究 [D]. 南京：南京林業大學，2007.

[4] 潘曉韻，沈曉嵐，朱開元，等. 鳥巢蕨的組培快繁技術[J]. 浙江農業科學，2014(7)：1049-1050.

[5] 袁玲. 兩種觀賞蕨類植物離體快繁體系的建立[D]. 武漢：華中農業大學，2007.

[6] 郭紅娟. 幾種藥用蕨類植物孢子繁殖和配子體發育及葉表皮研究[D]. 桂林：廣西師范大學，2010.

[7] 葉曉青，李紅，佘建明，等. 鳳尾蕨離體培養微繁殖技術[J]. 江蘇農業學報，2010，26(6)：1445-1446.

[8] 韋景楓，匡世秀，陶文丞，等. 鳳丫蕨組培快繁技術初報[J]. 貴州林業科技，2004，32(3):32-34.

(責任編輯：張瑞麟)

2017-01-17

西南林業大學科技創新項目(C16051)

管菊(1991—)，女，云南宣威人，碩士研究生，研究方向為觀賞植物繁殖與栽培，E-mail：710029000@qq.com。