膠體金免疫層析法對重金屬汞殘留的快速檢測

王 森，葉國華，陳笑笑，胡葉軍*，周麗燕

(1.紹興市農產品質量監督檢驗測試中心，浙江 紹興 312000； 2.杭州南開日新生物技術有限公司，浙江 杭州 310051)

膠體金免疫層析法對重金屬汞殘留的快速檢測

王 森1，葉國華1，陳笑笑2，胡葉軍2*，周麗燕1

(1.紹興市農產品質量監督檢驗測試中心，浙江 紹興 312000； 2.杭州南開日新生物技術有限公司，浙江 杭州 310051)

采用免疫競爭法，將抗重金屬汞單克隆抗體—膠體金復合物包被在膠體金結合墊上，將人工合成的重金屬汞抗原包被在硝酸纖維素薄膜表面作為檢測線(T線)，其與待測樣品中重金屬汞競爭結合膠體金標記的重金屬汞單克隆抗體，并通過T線和C線上肉眼可見的顏色顯示檢測結果。檢測水質時，靈敏度最低值可達1 μg·L-1，整個檢測過程只需3～5 min。膠體金免疫層析法具有較高的靈敏度及特異性，操作便捷，可用于快速檢測重金屬汞殘留。

重金屬汞； 半抗原； 免疫測定； 膠體金

重金屬污染是水污染的主要問題之一，礦山開采、金屬冶煉、化工生產廢水、施用農藥化肥和生活垃圾等人為污染，以及地質侵蝕、風化等天然因素均能導致重金屬以各種形式進入水體。汞是最為常見的重金屬之一，汞中毒以慢性為多見，主要癥狀為精神-神經異常、齒齦炎、震顫，有時還會產生幻覺，急性中毒有腹痛、腹瀉、血尿等癥狀，20世紀50年代在日本發生的水俁病就是由于汞污染引起。我國《地表水環境質量標準》(GB 3838—2002)Ⅴ類地表水水質中汞的限量標準為1 μg·L-1，《生活飲用水衛生標準》(GB 5749—2006)中汞、鉛、鎘、銅的限量標準分別為1 μg·L-1。

目前，國內外檢測水質中重金屬的常見方法包括原子吸收光譜法(AAS)[1]、電感耦合等離子體法(ICP)[2]、原子熒光光譜法(AFS)[3]、溶出伏安法[4]、高效液相色譜法(HPLC)[5]、分光光度法[6]、酶抑制法[7]、生物化學傳感器[8]等，其中AAS、ICP、AFS、HPLC雖然靈敏度高，幾乎可以用于所有重金屬的檢測，但樣品前處理和檢測過程較復雜，難以實現現場或在線監測，儀器設備的安裝環境和使用維護要求較高。

免疫膠體金快速檢測法是20世紀90年代興起的一種新型免疫學檢測技術，其反應所需要的原料的全部或大部分均已整合到試劑中，與其他檢測方法相比，具有簡便、快速、方便等優點。這種檢測重金屬汞的免疫膠體金層析方法具有較高的靈敏度，適用于大規模樣本初篩和現場檢測。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

硝酸纖維素膜(NC膜)、玻璃纖維(Millipore公司)；重金屬離子(Hg2+、Pb2+、Cr2+、Cu2+、As3+、Cd2+、Mg2+)、氯金酸(HAuCl4·4H2O)、鑰孔血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、佐劑(FCA、FICA)、檸檬酸三鈉、羊抗鼠IgG、海藻糖、Tween-20(美國Sigma)；異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸(ITCBE日本化學同仁研究所)；聚乙二醇20000、HCl、Na2CO3、NaN3(華東醫藥有限公司)；PBS溶液、PBST溶液(試驗室自配)；包被抗原(Hg-ITCBE-BSA)、免疫抗原(Hg-ITCBE-KLH)[9]、Hg單克隆抗體[10](試驗室自制)。

BioJet XYZ3000型點膜儀(美國BioDot)；Avanti J-26XP高速冷凍離心機(美國Becman公司)；恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實業設備有限公司)；切割機(杭州市恒通設備有限公司)；膠體金讀數儀(杭州南開日新生物技術有限公司)；78HW-1恒溫磁力攪拌器(杭州儀表電機有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 試紙條和溶液配制

膠體金溶液配制。使用檸檬酸三鈉還原氯金酸法制備膠體金[11]。

金標抗體溶液配制。取1 L膠體金溶液使用K2CO3及HCl調整至最適標記pH值后，加入適量Hg2+螯合物單抗，放置12 h后加入5%BSA至BSA最終質量分數為1%，離心純化后沉淀用0.01 mol·L-1PB溶液(含1%BSA和0.05%NaN3)重懸，4 ℃保存備用。

1.2.2 試紙條組裝和樣本處理

如圖1所示，將稀釋好的Hg-ITBCE-BSA和羊抗鼠IgG按一定濃度噴于NC膜上，形成檢測線(T線)和質控線(C線)，將金標抗體溶液噴至玻璃纖維上作為金標結合墊，分別置于37 ℃烘箱干燥；將樣品墊、金標結合墊、NC膜、吸水墊黏于PVC板上，切成3 mm寬試紙條后，裝入塑料模板中壓成試劑板。

圖1 試紙條的結構

樣本處理。取水樣(經螯合劑EDTA處理)1 mL于5 mL離心管中，加入3 mL PBST溶液，混勻，待檢。本試紙條采用對比法判定，若檢測線(T線)顯色淺于控制線(C線)顯色，則判定為陽性；若檢測線(T線)顯色深于控制線(C線)顯色，或者顯色一樣深，則判定為陰性；若控制線(C線)沒有顯色，檢測線(T線)無論有無顯色，均判定為無效板。

1.2.3 T、C線包被濃度、金標抗體包被量

將抗原Hg-ITCBE-BSA用PBS溶液(含3%甲醇)稀釋成0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mg·mL-1共8個濃度，稀釋后按常規噴量1.0 μL·cm-1包被到NC膜上作為T線，保持C線及金標抗體濃度、噴量適量和不變，置于37 ℃干燥箱5 h后組裝成試紙條，用0.01 mol·L-1pH 7.4的PBST滴定，觀察T線顯色強度，讀取T/C值。

將羊抗鼠IgG用PBS溶液(含3%甲醇)稀釋成0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mg·mL-1，按噴量1.0 μL·cm-1包被到NC膜上作為C線，保持T線及金標抗體濃度、噴量適量和不變，置于37 ℃干燥箱5 h后組裝成試紙條，用0.01 mol·L-1pH 7.4的PBST滴定，觀察C線顯色強度，讀取T/C值。

將金標抗體包被到膠體金結合墊上(D525 nm=20，噴量分別為1.5、1.8、2.0、2.2、2.5、2.8、3.0、3.3、3.5 μL·cm-1)，保持T線及C線濃度、噴量適量和不變，置于37 ℃干燥箱5 h后組裝成試紙條，用0.01 mol·L-1pH 值7.4的PBST滴定，觀察T、C線顯色強度，讀取T/C值。

1.2.4 檢測溫度

將所有組分均相同的試紙卡，在4 ℃，15 ℃，20 ℃，25 ℃，37 ℃這5個不同環境溫度條件下，用去離子水樣和1 μg·L-1Hg2+溶液樣本檢測，比較顯色情況和檢測結果差異。

1.2.5 試紙條檢測特性

試紙條檢出限。取去離子水添加Hg2+至最終質量分數分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 μg·L-1，每個濃度設6個重復，樣本處理后滴板檢測并記錄試驗結果。

試紙條特異性。取Hg2+、Pb2+、Cr2+、Cu2+、As3+、Cd2+、Mg2+稀釋成梯度濃度后經樣本處理，分別使用試紙條檢測，記錄并比較結果。

試紙條穩定性。將試紙條置于25 ℃下，分別于1、2、3、6、9、12個月后抽取2組，每組3條試紙條，使用去離子水樣及1 μg·L-1Hg2+水樣檢測，觀察顏色變化。

2 結果與分析

2.1 T、C線包被濃度、金標抗體包被量

由表1可見，結合T線的顯色強度及顯色穩定性情況，最終確定抗原的工作濃度范圍為0.8～1.2 mg·mL-1。

由表2可見，C線二抗的工作濃度范圍為0.8～1.2 mg·mL-1。

由表3可見，結合C/T線顯色深淺和靈敏度高低，金標抗體的適宜包被量范圍為2.0～3.0 μL·cm-1。

表1 抗原工作濃度范圍

表2 羊抗鼠IgG工作濃度范圍

表3 金標抗體包被量范圍結果

2.2 檢測溫度

由表4可見，檢測溫度影響跑板速度，37 ℃相對15～25 ℃平均快6 S，相對4 ℃平均快11.5 S。15～25 ℃下檢測，檢測結果更準確，4 ℃下檢測結果相對偏陽，37 ℃下檢測結果相對偏陰。為避免出現假陽性和假陰性結果，保證跑板順暢，建議檢測時采用的環境溫度為15～25 ℃。

表4 不同檢測溫度對檢測結果的影響

2.3 試紙條檢出限

用試紙條對Hg2+的質量分數分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 μg·L-1進行檢測，結果當Hg2+≥1 μg·L-1時，試紙條呈陽性，當Hg2+<1 μg·L-1時，試紙條呈陰性，故試紙條的檢出限為1 μg·L-1。

2.4 特異性試驗

由表5可知，本試紙條中與常見重金屬Pb2+、Cr2+、Cu2+、As3+、Cd2+、Mg2+在100 μg·L-1濃度下無交叉反應，故特異性較高。

表5 試紙條特異性試驗結果

2.5 穩定性

由表6可知，25 ℃下試紙條的陰性及檢出限濃度下的檢測結果在12個月內保持不變，故其在25 ℃下至少可保存12個月。

表6 穩定性試驗結果

3 小結

使用膠體金免疫層析技術建立了一種快速檢測重金屬Hg2+的方法，試紙條對水中Hg2+的檢出限可達1 μg·L-1，滿足我國相關法規的要求。該方法前處理方法簡單，特異性強，可目測直接讀取試驗結果，檢測過程只需3～5 min，可用于水中重金屬Hg2+的快速篩查，但陽性結果仍需其他方法確證。

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(責任編輯：張瑞麟)

2017-03-23

紹興市公益性技術應用研究計劃項目(2014B70047)

王 森(1982—)，男，浙江新昌人，農藝師，碩士，從事農產品質量檢測工作，E-mail: 47419714@qq.com。

胡葉軍，E-mail: hyj664@163.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170635

S158

B

0528-9017(2017)06-1020-04

文獻著錄格式：王森，葉國華，陳笑笑，等. 膠體金免疫層析法對重金屬汞殘留的快速檢測[J].浙江農業科學，2017，58(6)：1020-1023.