秦艽不同加工品中有效成分含量與色度的相關性

王秀芬，冷曉紅，李 靜，陳海燕，郭鴻雁

(1.寧夏職業技術學院，寧夏 銀川 750021； 2.寧夏中藥材開發與利用工程技術研究中心，寧夏 銀川 750021)

秦艽不同加工品中有效成分含量與色度的相關性

王秀芬1，冷曉紅2，李 靜1，陳海燕1，郭鴻雁1

(1.寧夏職業技術學院，寧夏 銀川 750021； 2.寧夏中藥材開發與利用工程技術研究中心，寧夏 銀川 750021)

采用直接陰干、自然曬干、發汗干燥、80 ℃鼓風干燥等4種不同干燥方法對秦艽進行加工處理，采用HPLC法對秦艽中裂環烯醚萜苷類成分進行含量測定，比較不同加工方法對秦艽質量的影響；采用L*、a*、b*顏色特征參數描述“發汗”前后秦艽顏色，并對秦艽色度變化與成分含量變化進行考察。研究表明，不同加工方法的秦艽藥材中裂環烯醚萜苷類成分含量存在一定差異；“發汗”與“未發汗”秦艽色度與成分含量存在相關性。通過探討不同加工方法對秦艽藥材主要化學成分的影響，并對“發汗”前后秦艽的顏色變化進行數值描述，探討秦艽色度變化與成分含量的相關性。

秦艽； 加工方法； 裂環烯醚萜苷類成分； 色度

秦艽為龍膽科植物秦艽的干燥根，包括秦艽(GentianamacrophyllaPall.)、粗莖秦艽(GentianacrasicaulisDuthie ex Burk.)、麻花秦艽(GentianatramineaMaxim.)及小秦艽(GentianadahuricaFisch.)，具有活血化瘀，祛風除濕，利尿清熱功效，臨床上多用于治療風濕病、小兒疳熱以及便血等[1]。秦艽的主要活性成分為裂環烯醚萜苷類化合物，其中龍膽苦苷和馬錢酸苷含量較高，其他獐牙菜苦苷、獐牙菜苷以及6’-O-β-D-葡萄糖龍膽苦苷均具有良好的藥理活性[2-6]?！鞍l汗”是一種常見的中藥材產地初加工技術，其目的既有利于藥材的干燥，即藥材密閉堆積后發熱，其內部水分外溢；又可在“發汗”過程中使藥材中的某些化學成分發生一些變化，藥材或變色，或增加香氣，減少刺激性[7-12]。2015年版《中國藥典》規定秦艽可發汗處理，發汗后表面呈紅黃色或灰黃色。但目前在秦艽的產地加工中，不少產地采用不經發汗，直接干燥的方法。目前對秦艽的產地加工方法研究報道較少。本試驗以寧夏地產秦艽為研究樣本，采用HPLC法對不同加工方法秦艽中裂環烯醚萜苷類成分進行含量測定，比較不同加工方法對秦艽質量的影響；采用色差儀對發汗與未發汗秦艽測量顏色特征參數，對藥材的顏色差異進行數值化研究；并對秦艽色度變化與成分含量變化進行考察，為秦艽的產地加工提供科學評價依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗材料為龍膽科植物秦艽的干燥根，2015年10月采自寧夏六盤山隆德西北藥材公司秦艽種植基地。經寧夏藥檢所鑒定為秦艽的干燥根。

1.2 儀器試劑

高效液相色譜儀Agilent1220、Agilent C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫公司)，自動進樣器，DAD紫外檢測器；電子析天平(十萬分之一，Mettler Toledo儀器(上海)有限公司)；GZX-9030MBE型恒溫鼓風干燥箱(上海博訊實業有限公司)；CS-10精密色差儀(邦億精密量儀(上海)有限公司)；扁形稱量瓶等。

5種對照品分別為馬錢酸苷對照品(批號111865-201403)、龍膽苦苷對照品(批號110770-201515)、獐牙菜苦苷對照品(批號110785-201404)(中國食品藥品檢定研究院)、獐牙菜苷對照品(批號150401 HPLC≥98%)、6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷對照品(批號141122 HPLC≥98%)(成都菲德生物技術有限公司)；色譜純乙腈(天津市科密歐化學試劑開發中心)；試驗用水為重蒸水；其余試劑為分析純。

1.3 不同加工方式秦艽樣品的制備

將鮮秦艽藥材根部除去泥沙，平均分為4份，分別按下述方法進行加工處理，備用。

直接陰干品。將秦艽新鮮藥材放于陰涼通風處，攤開陰干。

自然曬干品。將秦艽新鮮藥材放于通風處，攤開太陽弱光下直接曬干。

直接堆置發汗品。將秦艽新鮮藥材放于通風處，攤開太陽弱光下曬2～3 d，曬軟，堆置，上部和四周用麻袋或塑料薄膜覆蓋，堆置“發汗”、至表面呈紅黃色或棕黃色時，攤開曬干。

80 ℃干燥品。將秦艽新鮮藥材平攤于烘盤內，采用電熱鼓風干燥箱80 ℃烘干。

1.4 裂環烯醚萜苷類成分的測定方法及驗證

秦艽的主要活性成分為裂環烯醚萜苷類化合物，2015年版《中國藥典》將龍膽苦苷和馬錢苷酸這2個化合物作為藥材質量評價的指標性成分。現代藥理學研究結果顯示，除龍膽苦苷和馬錢苷酸外，其他多種環烯醚萜苷成分均具有良好的藥理活性。獐牙菜苦苷、獐牙菜苷及6’-O-β-D-葡萄糖龍膽苦苷均對f MLP誘導產生的超氧化物的生成有抑制作用[13]。依此，本研究確定以馬錢酸苷、龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、6’-O-β-D-葡萄糖龍膽苦苷5種活性成分的質量分數作為秦艽質量評價的指標。

1.4.1 色譜條件

ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A為0.05%磷酸，流動相B為乙腈，洗脫梯度為0～13 min (91∶9～91∶9)，13～18 min (91∶9～89∶11)，18～23 min (89∶11～80∶20)，23～28 min (80∶20～74∶26)，28～40 min (74∶26～85∶15)；檢測波長240 nm；流速0.8 mL·min-1；進樣量20 μL，柱溫30 ℃；記錄色譜圖。

1.4.2 對照品溶液的制備

取馬錢酸苷、龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含馬錢酸苷0.309 4 mg、龍膽苦苷1.144 8 mg、獐牙菜苦苷0.226 8 mg、獐牙菜苷0.028 mg、6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷0.160 2 mg的混合對照品溶液，即得。

1.4.3 供試品溶液的制備

取本品粉末(過4號篩)約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHZ)30 min，放冷，再稱定重量，加甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

1.4.4 線性關系的考察

分別精密稱取馬錢苷酸、獐牙菜苦苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含馬錢苷酸2.21 mg，獐牙菜苦苷1.89 mg的混合對照品溶液，精密量取混合對照品溶液0.2、0.4、0.8、1.2、1.5 mL至10 mL的容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用；精密稱取龍膽苦苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含龍膽苦苷3.62 mg，精密量取龍膽苦苷對照品溶液1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL至5 mL的容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用；精密稱取6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷0.89 mg，精密量取6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷對照品溶液0.2、0.4、0.8、1.5、2.2 mL至10 mL的容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用；精密稱取獐牙菜苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含獐牙菜苷1.75 mg，精密量取獐牙菜苷對照品溶液0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mL至10 mL的容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用，按上述色譜條件進行測定，以質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，見表1。

表1 線性關系考察

1.4.5 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液10 μL，連續進樣6次，測定對照品色譜峰面積，所得馬錢酸苷、龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷峰面積的相對標準偏差(RSD)分別為1.79%、1.59%，1.82%、1.85%、1.92%，表明儀器精密度良好。

1.4.6 重復性試驗

精密稱取同一供試品粉末，按1.4.3方法平行制備供試品溶液6份，測定各成分含量，得到馬錢酸苷、龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷的RSD分別為2.09%、1.59%、2.05%、2.01%和2.17%。

1.4.7 穩定性試驗

取同一供試品溶液，按樣品含量測定方法，分別在0、2、4、6、8 h進樣測定5種成分的峰面積，馬錢酸苷、獐牙菜苷、獐牙菜苦苷、6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、龍膽苦苷峰面積的RSD分別為2.16%、2.23%、2.08%、2.57%、1.38%，表明供試品溶液在8 h內穩定。

1.4.8 加樣回收率

取已知質量分數的秦艽樣品粉末6份，約0.5 g，精密稱定，分別按已知質量分數的50%加入馬錢酸苷、獐牙菜苷、獐牙菜苦苷、6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、龍膽苦苷對照品，按1.4.3方法制備樣品，依1.4.1項下色譜條件進樣，每次進樣量為10 μL，測定5種化學成分的質量分數，計算各成分平均回收率依次分別為98.2%、99.6%、99.4%、97.2%和100.2%，RSD分別為2.8%、2.1%、2.2%、3.1%和1.8%。

1.5 色澤測定方法

中藥材在顏色方面的性狀特征常常是評價中藥材質量的重要依據[14]，目前對這些性狀特征的評價主要是依據經驗主觀描述。本試驗采用色差儀對秦艽“發汗”所產生的性狀變化進行數值描述，將有助于科學化評價中藥材質量。

以色差儀對“發汗”秦艽與未“發汗”秦艽樣品的顏色進行測定，分析記錄樣品的參數L*、a*和b*值，每個樣品測定2次，以平均值計。色差儀測定條件：照明光源D65，狹縫寬度1 nm，視場選擇10°角，波長掃描范圍380～780 nm。

2 結果與分析

2.1 樣品的含量測定

取不同加工方式秦艽樣品粉末，平行2份，按1.4.3項下條件制備樣品溶液，依1.4.1項下色譜條件進樣，每次進樣量為10 μL，進行裂環烯醚萜苷類成分含量測定。

表2結果表明，在秦艽不同的加工方法中，以80 ℃干燥，主要藥效成分龍膽苦苷、獐牙菜苷、獐牙菜苦苷的含量較高。

表2 秦艽不同加工樣品裂環烯醚萜苷類成分含量

2.2 色度

2.2.1 色度測定

應用色差儀按1.5項下色澤測定方法測定不同樣品色度參數值，結果見表3。采用SPSS19.0統計軟件對試驗數據進行分析。

表3 秦艽各樣品色度參數值

對試驗數據進行卡方檢驗分析，χ2值為69.360，P值為0，表明發汗和未發汗秦艽在顏色上存在差異，且在數值上體現為L*、a*、b*值的顯著性差異。

2.2.2 判別分析

由組均值均等性檢驗結果可知，L*、a*、b*值3個自變量P值均為0，表明在秦艽發汗和未發汗的顏色特征參數L*、a*、b*均有統計學意義。其中，L*、a*、b*的λ值分別為0.020、0.077和0.014。根據λ值越接近0，組間判別越顯著這一原則，可知L*、b*的判別更有意義。

綜上，L*、b*參數值在發汗秦艽與未發汗秦艽樣品上存在差異，說明明度和黃藍色度是評價秦艽樣品顏色的主要指標。

2.3 色度變化與成分含量變化的相關性

將鮮秦艽藥材根部除去泥沙，平均分為9份，其中1～3號樣品采用自然干燥，4～6號樣品曬干表皮采用“發汗”干燥，7～9號樣品采用80 ℃鼓風干燥。

2.3.1 樣品含量和色度

取上述不同加工方式秦艽樣品粉末，進行裂環烯醚萜苷類成分含量測定和色度測定，結果見表4。

表4 秦艽不同加工樣品裂環烯醚萜苷類成分含量及色度測定

秦艽藥材采用3種干燥方式，其中以80 ℃鼓風干燥藥材L*值最大，a*、b*最小，色澤明亮，偏紅、偏黃程度較小，顏色最淺，呈淡黃色；“發汗”干燥藥材L*值最小，a*、b*最大，色澤發暗，偏紅、偏黃程度較大，色澤最深，呈棕黃色；自然干燥藥材色澤介于兩者之間。從表4可知，秦艽采用“發汗”干燥，獐牙菜苷和獐牙菜苦苷含量明顯降低，6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷含量升高。

2.3.2 相關性

采用SPSS 19.0軟件對不同加工方式的秦艽藥材色度值與裂環烯醚萜苷含量(以龍膽苦苷、獐牙菜苷和獐牙菜苦苷之和計)之間分別進行Pearson相關性分析，結果見表5。

表5 秦艽不同加工樣品裂環烯醚萜苷類含量與 色度值相關性分析

注：1)為0.8～1.0極強相關；2)為0.6～0.8強相關。

由表5可知，不同干燥方式秦艽藥材裂環烯醚萜苷類成分含量與藥材色度均呈極強或強相關，其中藥材色度a*、b*值均與含量呈負相關，L*值與含量呈正相關。

3 討論

發汗是藥材加工的重要環節，可促使其中水分發散，化學成分在相關活性酶作用下轉化，提高藥材品質[15]。本試驗顯示，秦艽采用陰干、自然干燥、發汗干燥、80 ℃鼓風干燥4種干燥方式，其中以80 ℃鼓風干燥下的主要藥效成分龍膽苦苷、獐牙菜苷和獐牙菜苦苷的含量較高，堆置發汗干燥6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷的含量明顯增加；80 ℃鼓風干燥方式干燥藥材中，馬錢苷酸的含量低于堆置發汗干燥方式，但明顯高于陰干和自然干燥方式。因秦艽藥材須根較多，干燥過程中若不采用發汗干燥，須根易斷碎，嚴重影響藥材品質，所以在產地加工中可考慮采用80 ℃鼓風干燥和堆置發汗干燥方式相結合進行藥材干燥，這樣既可縮短干燥時間，又可保證藥材品質。兩種方法結合加工藥材療效是否更好，有待結合藥理與臨床研究進一步確定。

通過色差分析儀測定發汗與未發汗秦艽的顏色變化，秦艽發汗后顏色明顯加深。通過對發汗與未發汗秦艽色度變化與成分含量變化的考察，隨著秦艽藥材顏色加深，L*值減小，a*、b*值增大，裂環烯醚萜苷類成分含量逐漸降低，可能是由于發汗過程中相關酶的活性被激活，從而造成藥材中環烯醚萜苷類成分被水解，生成半縮醛結構的苷元，進一步聚合而產生棕黑色沉淀，使藥材顏色加深。采用80 ℃鼓風干燥直接將酶殺滅，從而抑制裂環烯醚萜苷類成分水解。因此，80 ℃鼓風干燥藥材顏色最淺，L*值增大，a*、b*值減小，而裂環烯醚萜苷類成分含量卻最高。發汗對藥材藥效活性影響的研究還很少，難以從藥效上來評價發汗這一產地加工的合理性及科學性。

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(責任編輯：張瑞麟)

2017-01-04

寧夏科技惠民項目(2015KJHM25)

王秀芬，女，副主任藥師，從事中藥材質量評價研究工作，E-mail：nxnxwxf@126.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170623

S567

A

0528-9017(2017)06-0976-05

文獻著錄格式：王秀芬，冷曉紅，李靜，等. 秦艽不同加工品中有效成分含量與色度的相關性[J].浙江農業科學，2017，58(6)：976-980.