頂空氣相色譜法測(cè)定利奧西呱原料藥中9種殘留溶劑的含量

楊昭毅，劉 斌

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥 230001）

頂空氣相色譜法測(cè)定利奧西呱原料藥中9種殘留溶劑的含量

楊昭毅，劉 斌

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥 230001）

建立同時(shí)測(cè)定利奧西呱原料藥中殘留溶劑甲醇、異丙醇、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、六甲基二硅醚、三乙胺、甲苯與N，N-二甲基甲酰胺殘留量的方法。采用頂空進(jìn)樣氣相色譜法，以二甲基亞砜為溶劑，外標(biāo)法計(jì)算殘留溶劑量。9種殘留溶劑色譜峰的理論板數(shù)均＞10 000，相鄰峰的分離度均＞1.5，在考察的濃度范圍內(nèi)各溶劑線性關(guān)系良好（r=0.9982～0.9997）；RSD＜10%；平均加標(biāo)回收率為90.86%～105.01%。各殘留溶劑的檢測(cè)限和定量限分別為0.000025%～0.0026%，0.000051%～0.0088%，均低于《中國(guó)藥典》規(guī)定。利奧西呱原料中檢出甲醇、正己烷、乙酸乙酯與DMF殘留，但均未超過限度，其余溶劑未檢出。該方法操作簡(jiǎn)單、方法靈敏、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于利奧西呱原料藥中殘留溶劑檢測(cè)。

利奧西呱；頂空進(jìn)樣氣相色譜法；殘留溶劑；外標(biāo)法

0 引 言

利奧西呱（Riociguat）是一種口服的可溶性鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑。2013年9月獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)，是第一個(gè)獲得批準(zhǔn)的治療肺動(dòng)脈高壓（PAH）和慢性血栓栓塞性PAH（CTEPH）的孤兒藥[1]。2014年初，日本及歐洲也相繼批準(zhǔn)利奧西呱用于治療CTEPH和PAH。我國(guó)食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）于2014年3月也受理了利奧西呱口服片劑進(jìn)口的申請(qǐng)。臨床試驗(yàn)表明，利奧西呱在治療PAH和CTEPH上療效確切，具有良好的安全性及耐受性；且該藥為口服制劑，服用方便，具有良好的市場(chǎng)前景[2-3]。

在該藥的合成過程[4]中，需要使用人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）限制使用的第2類溶劑（甲醇、二氯甲烷、正己烷、N，N-二甲基甲酰胺與甲苯）和限制使用的第3類溶劑（異丙醇、乙酸乙酯）[5]。這些溶劑會(huì)對(duì)人體健康和環(huán)境造成危害，控制其殘留量對(duì)保證藥品質(zhì)量和用藥安全具有重要的意義。目前國(guó)內(nèi)尚未見有關(guān)利奧西呱原料藥殘留溶劑的檢測(cè)方法報(bào)道。為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，本文建立了頂空氣相色譜法測(cè)定利奧西呱原料藥中9種有機(jī)溶劑殘留量的方法。

1 儀器與材料

7890氣相色譜儀（FID檢測(cè)器）、7697A頂空進(jìn)樣器、毛細(xì)管色譜柱DB-624（30m×0.530mm×1.80μm），美國(guó)Agilent公司；AL-104電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

甲醇、異丙醇、二氯甲烷、六甲基二硅醚、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亞砜（DMSO）均為色譜純。甲苯、三乙胺、乙酸乙酯、正己烷均為分析純。

鹽酸利奧西呱原料，批號(hào)分別為141110，141112，141114（某制藥有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為 DB-624（30 m×0.530 mm×1.80 μm）毛細(xì)管柱。檢測(cè)器：氫火焰離子檢測(cè)器，進(jìn)樣口溫度230℃。柱溫采取程序升溫，起始溫度為40℃，維持3min，按15℃/min的速率升溫至200℃，保持1min。頂空進(jìn)樣，檢測(cè)器溫度250℃；頂空平衡溫度為75℃，平衡時(shí)間為20min，進(jìn)樣體積為5mL。

2.2 溶液配制

空白溶劑：取DMSO 5 mL，置頂空瓶中，密封，即得。

對(duì)照品溶液：精密稱定甲醇1 500 mg、異丙醇2500mg、二氯甲烷 300mg、正己烷145mg、乙酸乙酯2 500 mg、六甲基二硅醚40mg、甲苯450mg、三乙胺160mg、DMF 440mg，分別用 DMSO 稀釋至 50mL，即為儲(chǔ)備液。精密量取上述儲(chǔ)備液1mL置同一100mL容量瓶中加DMSO至刻度，搖勻得對(duì)照品溶液。取5mL置頂空瓶中，密封備用。

供試品溶液：取鹽酸利奧西呱原料約1 g，精密稱定，置10mL容量瓶中，加DMSO溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5mL，置頂空瓶中，密封即得。

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別精密量取2.2項(xiàng)對(duì)照品溶液5.0mL，在2.1條件下進(jìn)樣測(cè)定，對(duì)各溶劑在色譜圖中的位置進(jìn)行定位。另精密量取供試品溶液，同法測(cè)定。空白溶劑、對(duì)照品溶液及供試品色譜圖見圖1。

圖1 氣相色譜圖

結(jié)果表明，甲醇、異丙醇、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、六甲基二硅醚、三乙胺、甲苯與DMF的保留時(shí)間分別為 2.777，4.298，4.637，5.206，6.021，6.667，6.867，8.531，9.573min。空白溶劑不干擾各殘留溶劑的檢測(cè)，對(duì)照品溶液中各溶劑峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于10 000，供試品中在甲醇、正己烷、乙酸乙酯與DMF處檢出殘留峰，本法專屬性良好。

2.4 線性關(guān)系

分別精密量取2.2項(xiàng)下各對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2，0.4，0.8，1.0，1.2mL置100 mL容量瓶中，加DMSO至刻度，搖勻，制成各對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線儲(chǔ)備液。

取上述標(biāo)準(zhǔn)曲線儲(chǔ)備液中甲醇10 μL、二氯甲烷20μL、DMF 100μL置10mL容量瓶A中；再分別取其他各標(biāo)曲儲(chǔ)備液0.1 mL置不同10 mL容量瓶中，加DMSO至刻度，搖勻后依次精密量取異丙醇400 μL、正己烷 100 μL、乙酸乙酯 300 μL、六甲基二硅醚800 μL、三乙胺 140μL、甲苯 300 μL 置于容量瓶A中，加DMSO稀釋至刻度，搖勻，制成混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液各5mL，置頂空瓶中，密封；按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，甲醇、異丙醇、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、六甲基二硅醚、三乙胺、甲苯與DMF的回歸方程及線性范圍見表1。結(jié)果表明：各溶劑在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與其峰面積均呈良好線性關(guān)系（r=0.9982～0.9997）。

表1 線性關(guān)系考察試驗(yàn)結(jié)果

2.5 精密度試驗(yàn)

精密量取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液各5mL（共6份），分別置頂空瓶中，密封。按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算得甲醇、異丙醇、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、六甲基二硅醚、三乙胺、甲苯與DMF峰面積的RSD 分別為 0.53%，0.36%，1.12%，4.82%，0.44%，3.22%，1.36%，0.31%，0.35%（n=6）。結(jié)果表明各溶劑峰面積的RSD均小于10.0%，本法精密度良好，滿足溶劑殘留測(cè)定要求。

2.6 回收率

精密稱取鹽酸利奧西呱原料1g，置10mL容量瓶中，分別精密加混合對(duì)照品溶液0.08，0.1，0.12mL，輕輕振搖使其溶解，加DMSO稀釋至刻度，搖勻，分別作為低濃度（80%）、中濃度（100%）和高濃度（120%）加標(biāo)溶液。每種濃度溶液平行制備3份，考察本方法的回收率，結(jié)果見表2。

表2 9種溶劑的回收率試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明9種溶劑在高、中、低各加標(biāo)量下回收率均在80%～120%之間，滿足殘留溶劑測(cè)定要求。

2.7 檢測(cè)限、定量限

精密量取2.2項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液，用DMSO逐級(jí)稀釋，精密量取各稀釋溶液5 mL，分別置頂空瓶中，密封。 以信噪比 S∶N=3∶1，10∶1 的濃度作為各溶劑的檢測(cè)限與定量限，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，結(jié)果見表3。

表3 9種殘留溶劑的檢測(cè)限、定量限

結(jié)果表明在上述色譜條件下，各殘留溶劑的檢測(cè)限和定量限均低于《中國(guó)藥典》[5]（Ch.P）規(guī)定限度，本法的靈敏度較高。

2.8 樣品溶劑殘留量測(cè)定

取鹽酸利奧西呱原料3批，按上述方法進(jìn)行殘留溶劑檢查，結(jié)果見表4。檢測(cè)結(jié)果表明3批樣品中均檢出甲醇、正己烷、乙酸乙酯與DMF殘留，各殘留均未超過限度，其余溶劑未檢出。

表4 利奧西呱樣品殘留溶劑檢查（n=3） %

3 討 論

3.1 進(jìn)樣方式的選擇

目前各國(guó)藥典測(cè)定有機(jī)溶劑殘留的方法主要為直接進(jìn)樣法和頂空進(jìn)樣法。通常情況下，沸點(diǎn)低的溶劑建議采用頂空進(jìn)樣法，沸點(diǎn)高的溶劑采用溶液直接進(jìn)樣法[6-7]，同時(shí)考慮到有機(jī)溶劑殘留檢測(cè)通常要同時(shí)檢測(cè)多種溶劑，為了提高檢測(cè)的可行性和簡(jiǎn)便性，有學(xué)者建議盡量在同樣的檢測(cè)條件下檢測(cè)盡量多種的殘留溶劑[8]。本品有機(jī)溶劑殘留量檢查中對(duì)低沸點(diǎn)的二氯甲烷、異丙醇、乙酸乙酯的測(cè)定首選為頂空進(jìn)樣法，據(jù)文獻(xiàn)[9-10]報(bào)道高沸點(diǎn)的DMF測(cè)定選擇頂空進(jìn)樣法亦可以滿足測(cè)定要求，故筆者選擇頂空進(jìn)樣法測(cè)定利奧西呱原料中9種有機(jī)溶劑的殘留量。

3.2 頂空平衡溫度及平衡時(shí)間的選擇

在頂空平衡時(shí)間為20min時(shí)，筆者分別考察了平衡溫度為65，75，85，95℃時(shí)的色譜峰峰面積。結(jié)果顯示，隨著平衡溫度的升高，色譜峰峰面積增大，但85℃以上后，各成分峰面積均無顯著增加；當(dāng)平衡溫度升高至95℃時(shí)，色譜圖中出現(xiàn)多個(gè)未知雜質(zhì)峰干擾測(cè)定結(jié)果，可能為DMSO受熱的分解產(chǎn)物[11]。在平衡溫度為75℃時(shí)，色譜圖中無未知雜質(zhì)峰，各成分均能滿足測(cè)定要求，因此選擇75℃作為平衡溫度。

頂空平衡有一定的時(shí)間要求，以保證樣品溶液的氣液兩相達(dá)到平衡，但也不宜過長(zhǎng)，否則會(huì)引起頂空瓶氣密性變差，導(dǎo)致定量準(zhǔn)確性降低[12]。在頂空平衡溫度75℃時(shí)，筆者分別考察了平衡時(shí)間為20，30，40min時(shí)的色譜峰峰面積。結(jié)果顯示，不同平衡時(shí)間的峰面積基本一致，說明20min已經(jīng)能達(dá)到氣液平衡，因此選擇20min為頂空平衡時(shí)間。

3.3 測(cè)定結(jié)果分析

根據(jù)對(duì)人體健康可能造成的危害，目前將殘留溶劑共分為4類69種。第2類殘留溶劑共28種，毒性比第1類溶劑小，屬于限制使用。第3類殘留溶劑共26種，是藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）或其他質(zhì)量要求限制使用的溶劑。此次測(cè)得的4種溶劑殘留中，甲醇、正己烷和DMF屬于第2類，乙酸乙酯屬于第3類，因此有必要對(duì)這4種溶劑殘留進(jìn)行控制，以確保該藥物的質(zhì)量和安全性，同時(shí)減少有機(jī)溶劑對(duì)環(huán)境的影響。

4 結(jié)束語

本實(shí)驗(yàn)首次采用頂空氣相色譜法對(duì)利奧西呱原料藥中的9種殘留溶劑進(jìn)行檢測(cè)。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明該方法色譜條件分離度良好，靈敏度高，在考察的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回收率符合規(guī)定，檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可以作為生產(chǎn)企業(yè)和有關(guān)檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)利奧西呱原料藥中的殘留溶劑進(jìn)行質(zhì)量控制方法，同時(shí)也可為從事相關(guān)殘留溶劑檢測(cè)的分析工作者提供參考。

[1]潘雄，程應(yīng)樟，程曉曙.治療肺動(dòng)脈高壓新藥-利奧西呱[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2016，51（2）：159-162.

[2]肖桂芝，劉永貴，湯立達(dá).治療栓塞性肺動(dòng)脈高壓和成人肺動(dòng)脈高壓新藥利奧西呱[J].中國(guó)新藥雜志，2015，24（1）：1-4.

[3] 孟曉冬，單福祥，王燕慧.肺動(dòng)脈高壓治療進(jìn)展[J].心血管病學(xué)進(jìn)展，2016，37（3）：319-322.

[4] 王宏博，鄧乾亞，袁博.利奧西呱的合成[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2016，47（6）：675-678.

[5] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：四部[M].2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：105-107.

[6]European Pharmacopoeia[M].8.0 edition.2013：141-145.

[7] 譚必琴，劉雁鳴.提高氣相色譜法測(cè)定藥物殘留溶劑靈敏度的方法[J].中南藥學(xué)，2016，14（8）：846-850.

[8]國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局.化學(xué)藥物殘留溶劑研究的技術(shù)指導(dǎo)原則[EB/OL].[2016-03-29].http：//www.cda.gov.cn/WS01/CL1616/83419.html.

[9]秦立，胡昌勤，劉文英.頂空氣相色譜法測(cè)定藥品中殘留溶劑的影響因素考察[J].藥物分析雜志，2005，25（7）：823-826.

[10]崇小萌，胡昌勤.利用中等極性氣相色譜系統(tǒng)分析藥物殘留溶劑[J].藥物分析雜志，2014，34（11）：2048-2053.

[11]張玲，楊華良，王家明.GC測(cè)定安立生坦原料藥中6種有機(jī)溶劑殘留[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2014，31（10）：1238-1241.

[12]楊晨，任鳳英，楊紅，等.頂空氣相色譜法測(cè)定鹽酸頭孢替安酯原料藥中殘留溶劑含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016，35（2）：177-180.

（編輯：莫婕）

Determination of 9 residual solvents in Riociguat by headspace gas chromatography

YANG Zhaoyi，LIU Bin
（Department of Pharmacy，Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University，Hefei 230001，China）

To establish a method for simultaneous determination of the nine residual solvents （methanol，isopropanol， dichloromethane， normal hexane， ethyl acetate， hexamethyl disiloxane， triethylamine，methylbenzene and N，N-dimethylformamide） in Riociguat.Headspace gaschromatographywas applied and dimethyl sulfoxide solvent was used.External standard method was adopted to calculate residual solvent content.The good linear relation of 9 kind of organic solvents were achieved（r=0.998 2 ～0.999 7） with theoretical plate number at chromatographic peak being ＞10 000 and resolution of adjacentpeak being ＞1.5 within investigated concentration range.The RSDs of precision was＜10%.The average recoveries ranged from 90.86%to 105.01%.Detection limit and quantitation limit(percentage in sample for test)were 0.000025%～0.0026%，0.000051%～0.0088%，which is lower than the regulations in Chinese Pharmacopoeia.The methanol， normal hexane， ethyl acetate and DMF were detected in Riociguat， and they are within limit.No othersolvents detected.The analyticalmethod issimple， accurate and sensitive， and is suitable forthe determination of residual solvents in Riociguat.

Riociguat； headspace gas chromatography； residual solvents； external standard method

A

1674-5124（2017）06-0042-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.06.009

2016-10-19；

2016-12-13

楊昭毅（1982-），男，安徽合肥市人，主管藥師，博士，研究方向?yàn)榕R床藥學(xué)、藥物分析。

劉 斌（1975-），男，安徽合肥市人，副主任藥師，碩士，研究方向?yàn)樗幬镏苿⑴R床藥學(xué)。