聚合水稻溫敏核不育基因和反溫敏核不育基因創制永久核 不育系

江建華 倪金龍 吳爽 王德正

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聚合水稻溫敏核不育基因和反溫敏核不育基因創制永久核 不育系

江建華 倪金龍 吳爽 王德正*

(安徽省農業科學院 水稻研究所/國家水稻改良中心合肥分中心/安徽省水稻遺傳育種重點實驗室，合肥230031；*通訊聯系人，E-mail：wdzhengqin@163.com)

【目的】制種安全是影響兩系雜交稻持續健康發展的關鍵問題。本研究旨在探索解決兩系雜交水稻的制種安全隱患途徑。【方法】以16個（光）溫敏核不育系與4個反溫敏核不育系配組并對F1育性進行觀察，選擇矮紫S（溫敏核不育系）和矮雁s（反溫敏核不育系）為構建永久核不育系的供源親本。通過回交將矮紫S和矮雁s的育性基因導入到橋梁親本天豐B中，分別育成天豐B的近等基因系天豐S和天豐s。【結果】天豐S和天豐s雜交獲得的天豐Ss即為永久核不育系。對天豐Ss的育性、可恢性等特性的研究表明，天豐Ss在自然長日高溫和短日低溫下均表現不育；天豐Ss及其3個親本與5個恢復系雜交的F1組合結實率無明顯差異。【結論】永久核不育系的創制有望從根本上解決兩系雜交水稻的制種安全問題。

水稻；溫敏核不育；反溫敏核不育; 永久核不育系

兩系法雜種優勢的利用不受恢保關系限制，配組自由，與三系法相比能更廣泛地利用水稻種質資源中存在的雜種優勢[1-2]。近40年來，隨著研究的深入和種子生產技術的完善，高產優質多抗組合不斷育成并得到大面積推廣，為我國的糧食安全做出了重要貢獻[3]。雖然目前兩系雜交水稻育種技術亦趨于成熟[4-5]。但是，頻繁發生的兩系雜交稻大面積制種失敗事件，已成為影響國家糧食安全和社會穩定的隱患[6-7]。如何有效解決兩系雜交稻制種安全問題已成為擺在我國水稻育種家及研究者面前的重要課題。為此，研究者提出了諸多解決方案，主要可以概括為以下三點：一是降低水稻兩用核不育系不育起點溫度以及延長其耐低溫時間[7]；二是注重兩系制種基地和時段的選擇[8]；三是嚴格控制水稻兩用核不育系不育起點溫度的漂變[9]。以上方案能在一定程度上降低制種風險，然而并不能從根本上解決問題。

目前報道的水稻兩用核不育系主要可以分為光溫敏（長日高溫不育型）、溫敏（高溫不育型）、反光溫敏（短日低溫不育型）和反溫敏（低溫不育型）4種類型[6-7,10]。但當前生產上大面積應用的均為溫敏或光溫互作類型，對于反（光）溫敏核不育系的研究很少。自1991年李訓貞等[11]對反溫敏核不育系N-10s和N-13s的育性鑒定以來，目前僅有幾篇關于反溫敏核不育系研究的報道，且主要集中于反溫敏核不育系本身對溫、光反應特性的研究[12-13]，尚未見反（光）溫敏核不育系育種利用的報道。梁滿中等[14]以反溫敏核不育系go543S與光溫敏核不育系農墾58S、7001S、培矮64S和長選3S配制雜交F1，發現這4個組合的F1在自然長日高溫、短日低溫和不同人工光、溫處理條件下花粉均表現不育，自交結實率為0，并未出現像go543S或農墾58S那樣的育性轉換現象。本課題組多年來一直從事兩系雜交水稻的育種研究工作[15-16]，受梁滿中等[14]反溫敏核不育系與光溫敏核不育系雜交F1不育的啟發，本研究利用橋梁親本構建了溫敏核不育和反溫敏核不育的近等基因系，通過對近等基因系雜交F1的育性、可恢性、產量競爭優勢及繁殖特性進行系統研究，以期為解決兩系雜交水稻的制種安全問題提供些許參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料包括20個不育系，其中秈型溫敏核不育系9個，粳型光溫敏核不育系7個，秈型反溫敏核不育系3個以及粳型反溫敏核不育系1個；恢復系5個和橋梁親本1個。詳細信息見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 永久核不育系供源親本的篩選

2008年夏在安徽廬江基地、2009年春在海南陵水基地利用9個秈型溫敏核不育系與3個秈型反溫敏核不育系以及7個粳型光溫敏核不育系和1個粳型反溫敏核不育系進行正反交兩兩配組，共配制了68個組合。2009年夏將配制成功的59個F1組合及其親本種植于廬江基地，5月8日播種，6月7日移栽。各材料種植3行，每行9株，株行距16.7 cm×26.7 cm。以各組合中50%的植株幼穗中部露出劍葉葉鞘時記為該組合的抽穗期；于抽穗20 d后調查各F1組合中間5株的總有效穗數、總粒數和總實粒數，計算單穗總粒數、單穗實粒數以及結實率；對于不結實的雜交組合割茬再生，并調查再生植株抽穗15 d后的單穗總粒數、單穗實粒數和結實率，方法同上。

1.2.2 永久核不育系直接親本的選育

以優質、多抗、綜合性狀優良的骨干親本三系保持系天豐B為橋梁親本，分別利用篩選到的供源親本矮紫S和矮雁s與其雜交、自交以及回交，直至獲得除育性外，其余性狀與天豐B基本一致的溫敏核不育系（天豐S）和反溫敏核不育系（天豐s），選育過程如圖1。

1.2.3 永久核不育系育性調查

2015年4月30日起將永久核不育系天豐Ss、直接親本天豐S、天豐s以及供源親本矮紫S分8期播種于廬江基地，每10 d一期，25 d后移栽。自始穗期開始，每隔2~4 d各材料分別取5穗，每穗取上、中、下3個部位已成熟但尚未開花的花藥1個，用1%的碘-碘化鉀溶液染色，鏡檢3個視野中的花粉染色情況，統計不同播期各材料的花粉敗育率，直至抽穗結束；同時每次鏡檢時各材料均選5個已抽穗但尚未開花的穗套自交袋并標注日期，成熟后考查單穗總粒數和實粒數，計算自交結實率。

1.2.4 永久核不育系的可恢性、產量競爭優勢及繁殖特性調查

可恢性和產量競爭優勢的測定：2016年春在海南陵水以永久核不育系及其3個親本為母本與5個秈稻恢復系按×模式配制20個雜交組合；2016年正季將上述所配組合及其親本種植于安徽廬江基地，5月10日播種，6月10日移栽。單本種植，各材料均種植3行，每行9株，株行距16.7 cm×26.7 cm。3次重復，隨機區組排列，常規栽培管理。成熟時，各小區取第2行中間5株調查單株有穗數、總粒數和實粒數，曬干脫粒揚凈后稱重，計算單株總粒數、單株實粒數、結實率和單株產量；從各重復中隨機取出飽滿稻谷1000粒稱重，3次重復的均值即為該材料（組合）的千粒重。

繁殖特性調查：2016年7月10日將天豐S和天豐s播種于廬江基地，7月29日移栽，株行距13.3 cm×13.3 cm，父母本間距26.7 cm，天豐S與天豐s行數比為10∶2，栽插面積0.09 hm2，父母本開花期噴施赤霉素調節株高，并輔以人工趕粉，成熟時收種，曬干揚凈稱重。

2 結果與分析

2.1 永久核不育系供源親本的篩選

7個粳型光溫敏核不育系與1個粳型反溫敏核不育系成對正反交配制了14個F1組合，同一組合正反交抽穗期基本一致。其中，粳518S/粳5278s F1正反交組合8月2日抽穗，粳519S/粳5278s F1正反交組合抽穗期分別為8月9日和11日，其余10個粳型正反交組合的抽穗期介于8月24－28日。

由表2可知，14個粳型F1正反交組合的結實率為68.99%~88.26%，表現正常可育。說明反溫敏核不育系粳5278s可以恢復本研究所用的7個粳型核不育系的育性，反之亦然。

秈型溫敏核不育系2301S、廣茉S、廣占63S和新二S與3個秈型反溫敏核不育系所配24個正反交組合的抽穗期介于8月11－23日；24個正反交組合結實率為65.71%~86.52%，表現正常結實(表2)。說明上述4個溫敏核不育系可以恢復這3個秈型反溫敏核不育系的育性，這3個秈型反溫敏核不育系也可以恢復以上4個秈型溫敏核不育系的育性。

表1 試驗材料

圖1 利用天豐B為橋梁親本選育正反溫敏核不育近等基因系天豐S和天豐s

Fig. 1. Breeding procedures of near iso-genic lines Tianfeng S with thermos-sensitive genic male and Tianfeng s with reverse thermos-sensitive genic male by using bridge parent of Tianfeng B.

1892S、P88S、矮占43S、矮紫S和培矮64S與3個秈型反溫敏核不育系所配21個正反交組合的抽穗期介于8月21－28日，所有21個正反交組合的自交結實率均低于1.24%，表現不育（表2）。將上述21個組合的F1植株割茬再生，再生植株抽穗期為9月25日至10月5日，各組合再生植株抽穗15 d后的低溫自交結實率均為0，表現徹底不育。其中，P88S/雁農s、矮紫S/雁農s和矮紫S/矮雁s 3個正反交組合不同時期均徹底敗育，是創制永久核不育系供源親本的理想材料。結合表2不同組合每穗總粒數來看，矮紫S/矮雁s正反交組合的每穗總粒數多于P88S/雁農s和矮紫S/雁農s組合，且矮紫S和矮雁s均是本課題組自行選育、含有新型矮稈基因的2個核不育材料。基于此，本研究將矮紫S和矮雁s作為創制永久核不育系的供源親本。

2.2 永久核不育系的育性觀察

利用供源親本矮紫S和矮雁s分別與橋梁親本雜交并不斷回交，獲得除育性外其余性狀與天豐B一致的2個近等基因系天豐S（溫敏核不育系）和天豐s（反溫敏核不育系）。2015年春將天豐S和天豐s種植于海南陵水基地并雜交，獲得天豐S與天豐s的F1（天豐Ss），天豐Ss即為創制的永久核不育系。2015年夏將天豐Ss及其3個親本（矮紫S、天豐S和天豐s）種植于安徽廬江基地以觀察其育性。由表3可知，4個不育系花粉敗育率與套袋自交結實率結果一致。3種類型的不育系在不同溫度條件下，育性表現不同。溫敏核不育系矮紫S和天豐S長日高溫表現不育，其中供源親本矮紫S不育期從8月1日持續至9月9日，花粉敗育率達99.94%，套袋自交結實率不超過0.38%；而利用矮紫S選育的溫敏核不育系天豐S的不育期更長，從7月27日一直持續至9月12日，花粉敗育率高于99.61%，套袋自交結實率小于0.36%。可見，創制永久核不育系的直接親本天豐S比供源親本矮紫S的不育性更好。

反溫敏核不育系天豐s在8月1日至9月9日間花粉敗育率為0.33%~78.56%，套袋自交結實率在6.78%~86.54%，說明天豐s長日高溫下表現可育。

永久核不育系天豐Ss從始穗期（7月25日）至調查結束（9月19日），其花粉敗育率均達到99.51%以上，套袋自交結實率更是低于0.20%，說明永久核不育系天豐Ss無論是長日高溫還是短日低溫下均表現不育。

2.3 永久核不育系天豐Ss的可恢性及產量競爭優勢的測定

永久核不育系天豐Ss及其3個親本與揚稻6號等5個秈稻恢復系測配，成熟期調查所配組合的結實率及產量相關性狀。由表4可知，20個組合的結實率為69.8%~86.7%，其中利用永久核不育系天豐Ss所配5個組合的結實率更是高達82.6%，說明天豐Ss的育性可恢復。從另外4個產量相關性狀來看，除千粒重外，利用永久核不育系的3個親本所配15個組合的單株有效穗數、每穗總粒數和單株產量中分別有14個、10個和12個，小于利用天豐Ss所配相應組合。由上可知，本研究創制的永久核不育系天豐Ss的育性是可恢的，且其所配組合具有一定的產量競爭優勢。

2.4 永久核不育系天豐Ss的繁殖特性

溫敏核不育系天豐S和反溫敏核不育系天豐s是創制永久核不育系天豐Ss的直接親本。天豐S和天豐s在相同溫度條件下，育性表現相反。因此，永久核不育系天豐Ss的繁殖較當前生產上應用的溫敏核不育系如矮紫S等更加容易。如既能以天豐S為母本、天豐s為父本進行高溫夏繁繁殖天豐Ss，也能以天豐s為母本、天豐S為父本進行低溫秋繁或海南冬繁繁殖天豐Ss。2016年夏在安徽廬江基地以天豐S為母本，天豐s為父本制種0.09 hm2，收獲天豐Ss種子97.5 kg，平均1083 kg/hm2。產量較低可能與抽穗揚花期遇到長時間異常高溫導致父本天豐s花粉活力不足、異交結實率較低有關。

表2 水稻溫敏核不育系與反溫敏核不育系正反交F1每穗粒數和結實率的調查

溫敏核不育系(♀)×反溫敏核不育系(♂)為正交，反之為反交。

Forward hybridization, thermo-sensitive genic male sterile line (female) × reverse thermo-sensitive genic male sterile line (male), on the contrary, reverse hybridization. SNP, No. of spikelets per panicle; FGP, No. of filled grains per panicle; SSR, Seed-setting rate.

表3 永久核不育系天豐Ss及其3個親本自然條件下的育性表現

3 討論

本研究利用7個粳型溫敏核不育系與1個粳型反溫敏核不育系以及9個秈型溫敏核不育系與3個秈型反溫敏核不育系雜交配制了59個正反交F1組合。其中，所有14個粳型F1正反交組合以及2301S等4個秈型溫敏核不育系與3個秈型反溫敏核不育系所配的24個F1正反交組合的結實率為65.71%~88.26%，表現正常可育，說明上述所用的（光）溫敏核不育系中的不育基因與反溫敏核不育系中的不育基因聚合可以相互恢復育性。而1892S等另外5個秈型溫敏核不育系與矮雁s等3個秈型反溫敏核不育系所配21個正反交組合的自交結實率不超過1.24%，且這些組合的再生植株自交結實率為0，表現不育，這與梁滿中等[14]研究結果一致。通過系譜分析發現，9個秈型溫敏核不育系中，除2301S和新二S的育性基因（可能）來源于安農S-1外，其余7個溫敏核不育系的育性基因均來源于農墾58S。說明安農S-1的育性基因與雁農s的育性基因可以相互恢復育性；但來源于農墾58S的育性基因與來自雁農s的育性基因聚合卻出現可育與不育兩種類型，如廣茉S和廣占63S與雁農s等配組子代是可育的，而1892S、矮紫S、矮占43S、P88S和培矮64S與雁農s等配組則出現永久不育的現象。說明農墾58S可能含有2個以上的育性基因，從而導致其衍生后代含有不同的育性基因，即廣茉S、廣占63S與1892S等分別含有農墾58S中不同的育性基因。這需要我們進一步從分子層面上對溫敏和反溫敏核不育系的育性遺傳機理及兩者之間的作用方式進行遺傳解析。

表4 永久核不育系天豐Ss及其3個親本與5個秈稻恢復系配組F1產量相關性狀的表現

本研究將溫敏核不育系矮紫S和反溫敏核不育系矮雁s中的育性基因導入到橋梁親本天豐B中，育成分別只含有矮紫S和矮雁s育性基因而其他性狀均與天豐B一致的近等基因系天豐S和天豐s。天豐S與天豐s雜交子代天豐Ss無論是長日高溫還是短日低溫均表現不育，且天豐Ss與秈稻恢復系所配組合結實率正常并表現出一定的產量競爭優勢。因此，生產上利用永久核不育系天豐Ss進行兩系雜交稻制種時將不會出現由于溫度的異常變化而導致的“打擺子”現象，為解決當前兩系雜交稻制種安全問題提供了一條新的思路。但是，本研究大部分內容均是通過試驗設計進行的理論上的研究，生產上無論是永久核不育系天豐Ss的繁殖還是利用天豐Ss進行制種之前，不僅要明確創制永久核不育系的2個直接親本（天豐S和天豐s）的育性轉換臨界溫度以及天豐S、天豐s和天豐Ss的特征特性，特別是與制種產量緊密相關的開花習性，同時還要進行不同生態環境中的小規模制種試驗，為永久核不育系生產上大規模的應用與推廣奠定基礎。

[1] 袁隆平. 兩系法雜交水稻研究論文集. 北京: 農業出版社, 1992: 1-5.

Yuan L P. Two-line Hybrid Rice Research Papers. Beijing: Agricultural Press, 1992: 1-5. (in Chinese)

[2] 肖層林, 張海清, 劉愛民, 佘雪晴. 兩系法雜交水稻制種風險產生的原因及其控制對策. 雜交水稻, 2010(S1): 462-464.

Xiao C L, Zhang H Q, Liu A M, She X Q. Causes of the risk in seed production of two-line hybrid rice and its controlling strategy., 2010(S1): 462-464. (in Chinese)

[3] 斯華敏, 劉文真, 付亞萍, 孫宗修, 胡國成. 我國兩系雜交水稻發展的現狀和建議. 中國水稻科學, 2011, 25(5): 544-552.

Si H M, Liu W Z, Fu Y P, Sun Z X, Hu G C. Current situation and suggestions for development of two-line hybrid rice in china., 2011, 25(5): 544-552. (in Chinese with English abstract)

[4] Chen L Y, Xiao Y H, Lei D Y. Mechanism of sterility and breeding strategies for photoperiod/thermo-sensitive genic male sterile rice., 2010, 17(3): 161-167.

[5] Chloupek O, Forster B P, Thomas W T B. The effect of semi-dwarf genes on root system size in field-grown barley., 2006, 112(5): 779-786.

[6] Chen L Y, Lei D Y, Tang W B, Xiao Y H. Thoughts and practice on some problems about research and application of two-line hybrid rice., 2011, 18(2): 79-85.

[7] 唐文幫, 陳立云, 王建龍, 劉海, 肖應輝, 鄧化冰, 劉國華. 水稻溫敏型兩用核不育系繁殖存在的問題及解決辦法. 雜交水稻, 2011, 26(1): 25-29.

Tang W B, Chen L Y, Wang J L, Liu H, Xiao Y H, Deng H B, Liu G H. Problems of and solutions to multiplication of TGMS line in rice., 2011, 26(5): 25-29.

[8] 武小金. 兩系法雜交水稻安全高效種子生產技術. 北京: 中國農業出版社, 2005: 24-31.

Wu X J. The Seed Production Technology with Safe and Efficient of Two-line Hybrid Rice. Beijing: China Agricultural Press, 2005: 24-31. (in Chinese)

[9] 雷東陽, 唐文幫, 解志堅, 劉海, 陳立云. 兩系法雜交水稻制種不安全問題的解決途徑. 作物學報, 2013, 39(9): 1569-1575.

Lei D Y, Tang W B, Xie Z J, Liu H, Chen L Y. How to tackle insecurity problems in seed production of two-line hybrid rice., 2013, 39(9): 1569-1575. (in Chinese with English abstract)

[10] 陳立云. 兩系法雜交水稻的理論與技術. 上海：上海科學技術出版社, 2001: 102-105.

Chen L Y. The Principles and Techniques of Two-line Hybrid Rice. Shanghai:Shanghai Scientific and Technical Press, 2001: 102-105. (in Chinese)

[11] 李訓貞, 陳良碧, 周庭波. 新型低溫不育水稻(N-10s, N-13s)育性的初步鑒定. 湖南師范大學自然科學學報, 1991, 14(2): 376-378, 382.

Li X Z, Chen L B, Zhou T B. Preliminary observation of fertility changes in the new type low temperature sensitive male sterile rice N-10s and N-13s., 1991, 14(2): 376-378, 382. (in Chinese with English abstract)

[12] 吳厚雄, 李必湖, 向陽, 梁滿中, 徐孟亮, 陳良碧. 低溫敏核不育水稻go543S育性對溫, 光的反應. 生態學報, 2003, 23(3): 463-470.

Wu H X, Li B H, Xiang Y, Liang M Z, Xu M L, Chen L B. Effects of temperature and photoperiod on the fertility of low temperature sensitive genic male sterile rice., 2003, 23(3): 463-470. (in Chinese with English abstract)

[13] 徐孟亮, 張俊, 龔曼, 梁滿中, 陳良碧. 一個反向水稻兩用核不育系育性對溫度與光周期的反應. 湖南師范大學自然科學學報, 2010, 33(4): 85-88.

Xu M L, Zhang J, Gong M, Liang M Z, Chen L B. Response of fertility of a new reverse P(T)GMS line to temperature and photoperiod in rice., 2010, 33(4): 85-88. (in Chinese with English abstract)

[14] 梁滿中, 王曉輝, 吳厚雄, 陳良碧. 低溫敏核不育系與光溫敏核不育系雜交后代育性遺傳的初步研究. 作物學報, 2006, 32(10): 1537-1541.

Liang M Z, Wang X H, Wu H X, Chen L B. Preliminary studies on heredity of fertility for low temperature induced genic male sterile line and photoperiod (thermo)-sensitive genic male sterile line in rice (L.)., 2006, 32(10): 1537-1541. (in Chinese with English abstract)

[15] 王德正, 王輝, 吳爽, 杜士云, 江建華. 利用智能水溫控制系統鑒定水稻雄性核不育起點溫度. 中國稻米, 2015, 21(1): 24-29.

Wang D Z, Wang H, Wu S, Du S Y, Jiang J H. Identification of the critical sterility-inducing temperature of genic male sterile lines with intelligent water-temperature control system in rice., 2015, 21(1): 24-29. (in Chinese with English abstract)

[16] 吳爽, 江建華, 湯修竹, 王德正. 水稻溫敏核不育系廣茉S的異交特性研究. 雜交水稻, 2015, 30(3): 35-38.

Wu S, Jiang J H, Tang X Z, Wang D Z. Studies on outcrossing characteristics of TGMS line Guangmo S in rice., 2015, 30(3): 35-38. (in Chinese with English abstract)

Development of Permanent Genic Male Sterile Line by Pyramiding Thermo-sensitive Genic Male Sterile Genes and Reverse Temperature Induced Genic Male Sterile Genes in Rice (L.)

JIANG Jianhua, NI Jinlong, WU Shuang, WANG Dezheng*

(Institute of Rice ResearchAnhui Academy of Agricultural SciencesHefei Sub-center of China National Rice Improvement CenterAnhui Key Laboratory of Rice Genetics and BreedingHefei 230031China*Corresponding authorE-mailwdzhengqin@163.com)

【Objective】The security problem of seed production has seriously hampered the steadily and sustainable development of two-line hybrid rice. 【Method】Aizi S (thermos-sensitive genic male sterile, TSGMS) and Aiyan s (reverse temperature sensitive genic male sterile line, RTSGMS) were screened as the original parents to develop permanent genic sterile line (PGSL) according to the F1fertility of crosses among 16 (light-) TSGMS and 4 RTSGMS.The fertility genes were introduced into the near isogenic lines Tianfeng S and Tianfengs by backcrossing Aizi S and Aiyan s with the bridge parent Tianfeng B, respectively.Then, Tianfeng Ss, the PGSL, was observed from the cross between Tianfeng S and Tianfeng s. The fertility, restoration, competitive advantage of yield-related traits and reproductive characteristics of Tianfeng Ss were investigated. 【Result】Tianfeng Ss was completely sterile undernatural long day with high temperature and short day with low temperature.And no obvious difference was noted among the F1crosses from Tianfeng Ss and its three parents and five restorers in spikelet fertility percentage. 【Conclusion】The results showed that the newly developed PGSL might solve the security problem of seed production in two-line hybrid rice fundamentally.

rice; thermo-sensitive genic male; reverse thermo-sensitive genic male; permanent genic sterile line

10.16819/j.1001-7216.2017.7017

Q786; S511.0351

A

1001-7216(2017)04-0371-08

2017-02-14;

安徽省科技計劃資助項目(1501031096)；國家重點研發計劃資助項目(2016YFD0101105)。

修改稿收到日期：2017-03-30。