超級早稻中早39稻瘟病抗性的系譜分析

梁燕 季芝娟 曾宇翔 張翠真 吳晗霖 楊長登，*

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超級早稻中早39稻瘟病抗性的系譜分析

梁燕1季芝娟1曾宇翔1張翠真2吳晗霖1楊長登1，*

(1中國水稻研究所/水稻生物學國家重點實驗室，杭州310006；2長江大學生命科學學院，湖北荊州434023；*通訊聯系人，E-mail：yangchangdeng@126.com)

【目的】研究常規超級早秈稻品種中早39持久高抗稻瘟病的遺傳基礎，【方法】利用田間抗性鑒定、稻瘟病抗性基因分子標記檢測和基因測序的方法，分析中早39稻瘟病持久抗性的遺傳基礎?！窘Y果】中早39、金早47和中組3號對7個稻瘟病抗性基因和的分子標記均呈陽性條帶；且中早39與金早47、中組3號對5個稻瘟病生理小種的抗性表現完全相同。中早39與金早47、中組3號無論是表型還是基因型都完全一致；序列分析結果表明中早39系譜中的供試材料均含有抗病等位基因?！窘Y論】中早39的抗稻瘟病特性經中組3號，來源于金早47。含有的地谷與中早39、金早47和中組3號對5個稻瘟病生理小種的表型相同。

分子標記；抗性基因；基因測序；系譜分析

近年來，隨著社會發展，農業種植結構的進一步調整，我國的糧食安全隱憂突出[1]。常規早秈稻因其耐儲存、用途廣泛、商品性好等特點，特別是作為工業用糧的作用大大增加，是我國糧食安全的重要支撐。2013年中早39被農業部確定為超級稻品種，因其具有高產優質和持久抗稻瘟病的特點，連續6年(2011－2016)被農業部推薦為超級稻示范推廣品種[2]，最近幾年一直作為浙江省早稻區試的對照材料。2008－2009年浙江省早稻區域試驗中，中早39的稻瘟病抗性為抗或高抗。2013年中早39連創兩項浙江農業水稻高產紀錄，成為浙江省早稻種植面積最大的品種[3]。中早39作為恢復系廣泛應用于早稻育種中，由中早39配制的兩系雜交秈稻組合株兩優39也于2014年通過了國家審定。

前期研究中我們采用來自全國12個省市的 146個菌株對中早39進行了稻瘟病抗譜測定，結果表明中早39對秈型小種的平均抗譜為82.9%，對粳型小種的平均抗譜為71.2%。中早39對不同省市的稻瘟病菌株的抗譜不一致，對浙江、貴州和廣西的菌株抗譜分別為92.9%、93.1%和100%，說明中早39在這3個省份可以作為稻瘟病抗性育種的抗源使用[4, 5]。中早39是由中組3號和嘉育253雜交選育而成[6]，中組3號由金早47經無性系變異選育而成；早秈稻品種金早47是金華市農業科學研究所用中87-425/陸青早1號作親本選育而成[6](圖1)，田間表現高抗稻瘟病。追溯中早39的系譜并結合各品種的田間抗性表現，推測中早39對稻瘟病的抗性是經由中組3號來自金早47，但是缺乏理論依據。

聚集抗病基因是抗性育種的主要方法。鑒定、定位和克隆廣譜抗稻瘟病基因，對深入理解水稻廣譜抗病的分子機制，培育廣譜和持久抗病品種，持續有效控制稻瘟病具有重要意義[7]。前期研究結果表明，中早39廣譜持久抗性的基礎是含有抗性等位基因、和。和是水稻葉瘟抗性位點上的5個抗性等位基因中的兩個，其中來自小粒野生稻，抗譜廣；來自水稻品種BL1，對日本大多數稻瘟病菌小種有抗性，對中國的菌株ZB13和ZC15也表現抗病反應。源自Q61的稻瘟病抗性基因，對中國菌株CHL39有較強的葉瘟抗性，Pi36的第590個氨基酸由絲氨酸取代天冬氨酸；來源于粳稻羊毛谷，對秈稻小種表現廣譜高抗；源自秈稻品種地谷的主效抗稻瘟病基因，對我國稻瘟病生理小種ZB15表現較高的葉瘟抗性[6]。是單拷貝基因，編碼長度為825個氨基酸的跨膜受體蛋白激酶(RLK)，該激酶氨基端含有疏水性信號肽、β-lectin結構域、PAN域和TM域，羧基端是個典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域(STK)。因含有膜外β-lectin結構屬于新的抗病基因類型，其抗感差異是抗病蛋白的第441氨基酸由異亮氨酸(I)突變為感病蛋白的甲硫氨酸(M)造成的[6,8]；同樣源自秈稻地谷的主效抗稻瘟病基因，對我國稻瘟病生理小種Zhong-10-8-14表現較高的抗性水平[6,9]。因此，我們利用這7個抗性基因，研究中早39的系譜。

本研究利用田間接種鑒定、分子標記鑒定、抗性基因測序、生物信息學分析等方法，明確中早39中的抗稻瘟病的基因及其來源。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

中早39、嘉育253、中組3號、金早47、麗江新團黑谷、原豐早、CO39、地谷和稻瘟病鑒別品種(特特普、珍龍13、四豐43、東農363、關東51、合江18和麗江新團黑谷)，以及研究中用到的稻瘟病菌株均由中國水稻研究所水稻生物學國家重點實驗室育種新技術課題組提供。浙輻802、嘉育293、湘早秈1號、青谷矮3號和陸青早1號為中國水稻研究所水稻種質資源庫魏興華研究員提供, 系譜見圖1。其中麗江新團黑谷、原豐早和CO39作為稻瘟病鑒定的感病對照品種。

1.2 分子檢測

參照Warude等[10]的方法提取水稻全基因組DNA，1%瓊脂糖膠電泳和超微量分光光度計(Thermo Scientific NanoDrop 2000c, 美國)檢測其產量和質量。25 μL PCR體系和反應條件參照Liang等[7]，每對引物的退火溫度參照表1。用3%瓊脂糖凝膠(含GelRed)電泳分離后，于BIORAD凝膠成像儀下拍照。PCR產物送鉑尚生物技術(上海)有限公司測序，每個PCR獨立擴增，重復測序至少3次。

圖1 超級早稻中早39系譜

Fig. 1. The genealogy of super early rice Zhongzao 39.

DNA序列經BioEdit軟件人工校對和序列拼接。利用在線軟件“GeneScan (http://genes.mit.187edu/ genscan.html)和Fegenesh (http://linux1. softberry. com/berry. phtml? 188 Topic = fgenesh&group = programs & subgroup = gfind)”進行編碼區預測。利用在線軟件MultAli(http: //multalin.toulouse.inra.fr/ multalin)進行序列比對[11]。

1.3 接種鑒定

抗病表型鑒定所用的稻瘟病菌株分別采自浙江省(14-754、10-105、12-157、16-754)和江西省(16-161)早秈稻主產區重發病區的稻瘟病病穗。在稻瘟病鑒別品種特特普、珍龍13、四豐43、東農363、關東51、合江18和麗江新團黑谷上鑒定上述5個稻瘟病生理小種的致病類型，除了來自江西省的16-161屬于ZG類群外，其他4個菌株均屬于ZA和ZB類群(表2)。在中國水稻研究所實驗基地進行分生孢子分離、培養和接種。分生孢子接種濃度為2×105~5×105個/mL，添加0.2% 吐溫-20，在水稻分蘗盛期注射接種。一周后調查發病情況，依據國家農業行業標準(水稻稻瘟病鑒定技術規范)記載病情，以發病最重的稻株作為該品種的抗性級別，每個重復中只要有2 株以上感病即記為感(S)，低于2株記為抗(R)。

2 結果與分析

2.1 表型鑒定

中早39由中組3號和嘉育253雜交選育而來，而中組3號是金早47經無性系變異選育而成，田間表現具有與金早47一致的稻瘟病抗譜。供試材料接種于2016年8月3日，一周后的田間接種鑒定結果顯示(表3)，稻瘟病生理小種14-754侵染金早47、中組3號和中早39，而其他4個小種10-105、12-157、16-754和16-161則不能侵染這3個品種。金早47、中組3號和中早39對實驗中的5個生理小種的抗譜一致。系譜分析結果表明，稻瘟病生理小種14-754對系譜上游的浙輻802、嘉育293、湘早秈1號、青谷矮3號和陸青早1號表現免疫，從金早47開始致病，在中組3號和中早39發病。作為中早39親本之一的嘉育253除了對14-754表現感病外，對16-754也表現感病，說明中早39的抗稻瘟病特性源于中組3號和金早47。地谷對這5個菌株的抗病反應與金早47、中組3號和中早39完全一致(表3)。

表1 稻瘟病抗性基因檢測和序列分析所用到的引物

“*”用于基因測序的引物。

“*” indicates the primers for gene sequencing.

表2 鑒別品種對供試稻瘟病菌株的抗性表現

表3 供試材料的稻瘟病田間抗性表現

2.2 分子標記檢測

如圖2所示，稻瘟病抗性基因的分子標記在浙輻802、青谷矮3號、陸青早1號、金早47、中組3號和中早39中檢測到陽性條帶，而在其他三個供試材料中沒有檢測到目的條帶。、和四個抗性基因的特異性分子標記在9個供試材料中都檢測到陽性條帶。在嘉育293和嘉育253中未檢測到陽性條帶。在嘉育293和陸青早1號中未檢測到陽性條帶。值得注意的是，金早47、中組3號和中早39的基因型完全一致，本研究的抗性基因分子標記均能檢測到陽性條帶。

圖2 稻瘟病抗性基因分子標記檢測

Fig. 2. Molecular detection of the blast resistant genes.

Marker－DL2000。1~9分別代表浙輻802、嘉育293、湘早秈1號、青谷矮3號、陸早青1號、金早47、中組3號、嘉育253和中早39。CK+自上而下分別為-IRBL9-W、-地谷、-地谷、-Kasalath、-IRBLz-Fu、-IRBLb-B和-羊毛谷。CK-均為H2O。

Marker, DL2000. 1, Zhefu 802; 2, Jiayu 293; 3, Xiangzaoxian 1; 4, Qinggu’ai 3; 5, Luqingzao 1; 6, Jinzao 47; 7, Zhongzu 3; 8, Jiayu 253; 9, Zhongzao 39. From top to bottom, CK+ represent-IRBL9-W,-Digu,-Digu,-Kasalath,-IRBLz-Fu,-IRBLb-B and-Yangmaogu, respectively. CK-, H2O.

圖3 氨基酸序列比對分析

Fig. 3. Alignment analysis of amino acid sequences.

2.3 抗性基因序列分析

中早39和春江糯遺傳群體定位結果表明，中早39在所在的分子標記區間含有一個主效抗稻瘟病基因[5]。結合本研究的表型鑒定結果，中早39對5個稻瘟病生理小種的抗性表現與地谷一致，將的序列作為研究重點。將供試材料中等位基因的序列與其參考序列(：FJ915121)比較[8]，供試材料中共檢測到5個多態性位點，氨基酸多態性頻率為0.00062；檢測到3個單倍型，單倍型多態性頻率為0.556。將DNA序列轉換為氨基酸系列，與參考氨基酸序列(PID2：ACR15163.1)相比，供試材料中共檢測到兩個非同義突變D95N和H686R。其中，D95N由天冬氨酸突變為天冬酰胺，僅在金早47中檢測到；而H686R出現在所有的供試材料中，由組氨酸突變為精氨酸。

3 討論

在水稻抗病育種實踐中，明確抗病親本中抗性基因型可以更有效地應用于育種實踐[12-14]。對中早39的抗稻瘟病的遺傳背景研究，有助于從分子水平了解抗性基因在中早39中的來源與分布情況，為水稻稻瘟病抗性育種提供理論支持。

分子標記檢測結果表明中早39中含有本研究中用到的所有抗性基因位點和，從一個方面解釋了中早39具有持久和廣譜的稻瘟病抗性的原因。金早47和中組3號具有與中早39完全一致的基因型。田間接種鑒定的結果表明金早47、中組3號和中早39具有相同的抗譜。田間接種鑒定結果含有和的地谷具有與中組3號、金早47和中早39完全一致的抗譜，對稻瘟病生理小種14-754表現感病，對其他4個生理小種表現抗病，說明14-754可以侵染攜和抗性基因的水稻品種

前期的研究我們在中早39中所在的分子標記區間檢測到一個主效抗性基因位點(t)[5]，定位于水稻第6染色體上近著絲粒區域，與RM527和RM3連鎖，遺傳距離分別為3.2 cM和3.4 cM[15]。序列分析表明，中早39中的等位基因與參考序列相比具有一個非同義突變H686R，且這個突變普遍存在于所有的供試材料中。Li等[16]在35個亞洲栽培稻和6個野生稻中檢測到三個非同義突變S321L、I441M和H686R，其中H686R在所有的供試材料中均被檢測到，說明非同義突變H686R是普遍存在的。本研究中，所有的供試材料在第441個氨基酸均為異亮氨酸(I)，所以均為抗病等位基因。稻瘟病菌14-754使供試材料包括中早39、中組3號、金早47和地谷的抗病等位基因失去抗性，而浙輻802、嘉育293、湘早秈1號、青谷矮3號、陸青早1號中可能存在其他的抗性基因，對14-754表現抗病。后續實驗可利用稻瘟病生理小種14-754，將這5個材料中對14-754的抗性基因導入到中早39中，以提高其抗譜。

本研究從田間稻瘟病接種鑒定、稻瘟病抗性基因分子標記檢測和抗性基因測序分析3個方面證明，中早39的稻瘟病抗病特性經中組3號，來源于金早47。通過分析稻瘟病抗性基因的序列，確定中早39系譜中的供試材料均含有等位基因。

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Genealogical Analysis on Resistance toof Super Early Rice Zhongzao 39

LIANG Yan1, JI Zhijuan1, ZENG Yuxiang1, ZHANG Cuizhen2, WU Hanlin1, YANG Changdeng1,*

(1State Key Laboratory of Rice Biology, China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006, China;2College of Life Science, Yangtze University, Jingzhou 434023, China;*Corresponding author, E-mail: yangchangdeng@126.com)

【Objective】To clarify the genetic basis of the durable resistance toof the super early rice Zhongzao 39,【Method】blast resistance assessment, molecular marker screening and gene sequencing were conducted.【Result】Zhongzao 39, Jinzao 47 and Zhongzu 3 showed positive bands to all the molecular markers for 7 resistant genes,,,,,and; The resistance performance of Zhongzao 39, were fully consistent with Jinzao 47 and Zhongzu 3 to the 5 isolates collected from Zhejiang and Jiangxi Province, China; Molecular sequencing results showed that all the test materials containresistant alleles. 【Conclusion】These results showed that the genetic basis of durable resistance toof Zhongzao 39 was contributed by Jinzao 47 and Zhongzu 3.

molecular marker; resistant gene; gene sequencing; genealogical analysis

10.16819/j.1001-7216.2017.6165

S435.111.4+1; S511.034

A

1001-7216(2017)04-0441-06

2016-09-21;

中央級公益性科研院所基本科研業務費資助項目(2014RG001-3)。

修改稿收到日期：2017-03-23。