基于重測序的染色體片段代換系定位水稻抽穗期QTL

王軍 朱金燕 陶亞軍 周勇 范方軍 李文奇 王芳權 仲維功 楊杰,* 梁國華,*

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基于重測序的染色體片段代換系定位水稻抽穗期QTL

王軍1,2朱金燕2陶亞軍1周勇1范方軍2李文奇2王芳權2仲維功2楊杰2,*梁國華1,*

(1揚州大學江蘇省糧食作物現代產業技術協同創新中心/教育部植物功能基因組學重點實驗室, 江蘇揚州 225009；2江蘇省農業科學院糧食作物研究所/國家水稻改良中心南京分中心, 南京210014;*通訊聯系人, E-mail:ricegb@yzu.edu.cn)

【目的】水稻的抽穗期是決定水稻產量及其適用性的重要農藝性狀之一，是由多基因控制的數量性狀。染色體片段代換系減少了個體間遺傳背景的干擾，已經成為定位和克隆復雜性狀QTL的重要材料。【方法】本研究以9311為受體，日本晴為供體構建的128個重測序的染色體片段代換系群體為試驗材料，利用多元回歸，結合Bin-map圖譜，【結果】鑒定到6個在南京、揚州不同年份間穩定表達的抽穗期QTL，其中，被定位在第2染色體上的759 848 bp區間內；被定位在第2染色體上的45 286 bp區間內；被定位在第3染色體上的147 931 bp區間內；被定位在第5染色體上的213 351 bp區間內；被定位在第5染色體上的442 305 bp區間內；被定位在第8染色體上的538 176 bp區間內。【結論】本研究為精細定位并克隆相應QTL，進而探明抽穗期QTL的分子調控機制奠定了基礎。

水稻；染色體片段代換系；重測序；抽穗期

水稻是全世界最重要的糧食作物之一，全球有超過100個國家種植水稻[1]。稻米為全世界人口提供了21%的熱量和15%的蛋白質[1-2]，為我國人口提供70%熱量和65%的蛋白質[3]，保障水稻產量對全世界尤其對我國糧食安全至關重要。抽穗期是水稻重要農藝性狀之一，抽穗期通過決定營養生長期的長短，影響光合生產和物質積累，最終直接或間接地影響水稻的產量。水稻抽穗期受感光性、感溫性和基本營養生長性的影響，三者相互作用決定了水稻品種對地域和季節的適應性。水稻抽穗期遺傳基礎較為復雜，一般認為抽穗期是由主效基因和微效多基因共同控制，遺傳方式既有數量性狀遺傳特點，也有質量性狀遺傳特性，不同品種表現出不同的遺傳特點，即使同一品種的抽穗期也會由于溫光條件的不同而表現出不同的遺傳方式[4]。

水稻品種的抽穗期長短由其內在的遺傳發育機制和外在的環境因素(光照和溫度)共同決定的，這使得水稻抽穗期的遺傳機制非常復雜。截至目前，國內外的研究者利用F2/F3、BC1、DHs和RILs等傳統群體發現了618個抽穗期相關的基因(QTL)，分布于水稻全部12條染色體上，其中，只有20多個抽穗期相關基因(QTL)被克隆。究其原因是因為這些傳統的定位群體內QTL之間存在較復雜的互作和個體間遺傳背景的干擾，使對QTL的估計不準確，很難實現QTL的精細定位和克隆。染色體單片段代換系是利用分子標記輔助選擇技術建立起來的一套近等基因系，與其受體親本之間除代換片段存在差異外，其余部分均相同。通過比較染色體片段代換系與其受體親本之間的性狀差異，就可以定位到代換片段上的QTL。染色體片段代換系可以消除群體內遺傳背景的干擾，將復雜性狀分解為簡單性狀，已經成為復雜性狀QTL精細定位與克隆的最主要群體。在利用染色體片段代換系進行抽穗期QTL定位研究方面，Qiao等[5]利用198個9311為受體，普通野生稻為供體的染色體片段代換系定位了3個抽穗期相關QTL，位于第2和第10染色體上。Shen等[6]利用1套Zhenshan 97為受體，Minghui 63為供體的染色體片段代換系定位了12個抽穗期相關的QTL，分布在除了第5、10染色體外的其余10條染色體上。王軍等[7]利用廣陸矮4號為受體，日本晴為供體的85個染色體單片段代換系在南京和海南不同溫光條件下共定位到40個抽穗期相關的QTL，分布于水稻的全部12條染色體上。楊德衛等[8]利用9311為受體，日本晴為供體構建的94個染色體片段置換系定位了4個控制水稻抽穗期的QTL，分別位于第3、第4、第5和第8染色體。王韻等[9]利用Lemont和特青的雙向回交導入系群體在北京和海南2個環境下共定位了16個影響抽穗期的QTL，其中6個QTL在2個環境下都能檢測到。何鳳華等[10]以華粳秈74為受體，6個水稻品種為供體的52個單片段代換系鑒定出20個抽穗期QTL，這些QTL分布于水稻除第5、第6染色體外的10條染色體上。

染色體片段代換系大大提高了QTL定位的精確度，但由于染色體片段代換系構建是建立在分子標記檢測的基礎上，分子標記數量的有限性、分布的不均勻性及雙交換等問題的存在，可能導致一些小片段漏檢從而使得QTL定位不準確。本實驗室在前期研究中，分別以全基因組測序的秈稻品種9311、粳稻品種日本晴為受體和供體，構建了一套染色體單片段代換系群體并借助高通量全基因組重測序的方式對所有染色體片段代換系進行了精確的基因型鑒定[11]，所選用的材料遺傳背景清晰，導入片段和背景片段大小已知，可以準確地用于QTL定位研究。本研究利用這一套重測序的染色體片段代換系，于2012、2016年在揚州、南京共定位了6個穩定表達的抽穗期QTL，為進一步精細定位并克隆相應的QTL和選育適宜生育期的優質水稻新品種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以秈稻品種9311為受體親本，粳稻品種日本晴為供體親本，在回交和自交過程中利用覆蓋水稻全基因組分子標記進行輔助選擇，構建的128個染色體片段代換系及受體親本9311、供體親本日本晴為試驗材料。參考Huang等[12]的方法，通過高通量測序，對128個染色體片段代換系進行了重測序，每一個系的代換片段在染色體上的位置及長度都準確獲知，代換片段在水稻全基因組的覆蓋率為93.3%。

1.2 試驗方法

分別于2012年5月5日在揚州大學試驗農場(E1)；2016年5月15日在江蘇省農業科學院院部試驗田(E2)、5月5日在揚州大學試驗農場(E3) 3個生長環境種植128個染色體片段代換系群體以及2個親本。分別于6月5日、6月15日、6月5日進行移栽，每個系栽4行，每行15株，行、株距分別為26.7 cm和13.3 cm。3個環境下均種植對照，對照在田間均勻分布，每隔30個染色體片段代換系種植一個輪回親本9311作為對照小區，間比法順序排列。選取每個小區的中間2行的10株作為調查對象。在水稻剛開始抽穗的時候，調查每一株的最早穗的見穗日期，每天調查一次。抽穗期為從播種期到抽出第一個穗的天數。

1.3 QTL分析

Bin-map的制作參考Paran等[13]。對于整個群體而言，代換片段存在重疊區段，根據重疊和非重疊的區段，將供體片段切割并編碼，每一個切割后的小區段稱為Bin，根據整個群體的Bin信息繪制覆蓋基因組的Bin-map。根據128個染色體片段代換系的測序物理圖譜及代換片段的切割信息，繪制了代換片段的Bin-map，總共包括401個Bin，定義為X1～X401。Bin的長度為13 213～10 654 035 bp，平均長度為889 652 bp。QTL分析利用多元回歸分析方法，參考Xu等[11]的方法，結合Bin-map，每一個Bin作為一個變量，利用方差分析精確估計誤差，提高遺傳分析效率，采用多元回歸實現QTL的精確定位，回歸模型如下：

y為第系的性狀平均值；0為模型均值；是bin的總數；b為第個bin的偏回歸系數；x為第個體第個bin基因型的指示變量，依bin的基因型來源不同而取值，來自供體的bin取－1，來自受體親本的bin取1；e為隨機誤差。

1.4 QTL效應分析

QTL加性效應值的計算，參照Eshed等[14]的方法估算各個QTL 的加性效應值及加性效應貢獻率。加性效應值=(片段代換系的表型值－9311的表型值)/2；加性效應百分率=(加性效應值/9311的表型值)×100%。QTL的命名依照McCouch等[15]。

2 結果與分析

2.1 親本及128個染色體片段置換系的抽穗期

128個染色體片段代換系2012年在揚州(E1)的抽穗期為82.7～133.6 d(圖1-A)；受體親本9311的抽穗期為(108.0±1.2) d，供體親本日本晴的抽穗期為(97.7±1.3) d(圖1-D)，親本間抽穗期差異達到極顯著水平(<0.01)。128個染色體片段代換系2016年在南京(E2)的抽穗期為80.1～122.6 d(圖1-B)；受體親本9311的抽穗期為(99.1±1.5) d，供體親本日本晴的抽穗期為(86.1±1.2) d(圖1-D)，親本間抽穗期差異達到極顯著水平(<0.01)。128個染色體片段代換系2016年在揚州(E3)的抽穗期為75.2～120.8 d(圖1-C)；受體親本9311的抽穗期為(98.1±1.3) d，供體親本日本晴的抽穗期為(88.6±1.5) d(圖1-D)，親本間抽穗期差異達到極顯著水平(<0.01)。

A－E1環境中抽穗期分布; B－E2環境中抽穗期的分布; C－E3環境中抽穗期的分布; D－9311日本晴在不同環境中抽穗期的表型。

Fig. 1. Distribution of heading date in the chromosome segment substitution lines and parents in different environments.

2.2 抽穗期QTL分析

根據128個染色體片段代換系和9311抽穗期的表型值，結合Bin的圖譜，基于多元回歸分析方法，共定位到6個在3個環境中均能被檢測到的QTL(表1)。其中，第2和第5染色體上各有2個；第3和第8染色體上各有1個。被定位在第2染色體上的759 848 bp區間內；被定位在第2染色體上的45 286 bp區間內。這兩個QTL位于相鄰區間。被定位在第3染色體上的147 931 bp區間內；被定位在第5染色體上的213 351 bp區間內；被定位在第5染色體上的442 305 bp區間內；被定位在第8染色體上的538 176 bp區間內。

2.3 抽穗期QTL效應分析

對128個重測序片段進行分析，獲得了6個抽穗期QTL中5個抽穗期的單片段代換系。利用這5個染色體單片段代換系對QTL效應進行分析(表2)。表現為減效作用，在3個環境中加性效應分別為－11.5、－7.2和－10.5 d，加性效應百分率分別為－10.7%、－7.3%和－10.7%。表現為減效作用，在3個環境中加性效應分別－4.4、 －3.1和－3.6 d，加性效應百分率分別為－3.8%、－3.1%和－3.7%。表現為增效作用，在3個環境中加性效應分別1.4、2.5和1.6 d，加性效應百分率分別為1.3%、2.5%和1.6%。表現為增效作用，在3個環境中加性效應分別12.8、3.0和11.3 d，加性效應百分率分別為11.9%、3.0%和11.5%。表現為減效作用，在3個環境中加性效應分別－12.7、－8.4、－11.5 d，加性效應百分率分別為－11.7%、－8.5%和－11.7%。

表1 抽穗期 QTL的定位

表2 不同環境中抽穗期QTL效應分析

AEC, Additive effect contribution.

3 討論

水稻產量、品質、抗性等重要農藝性狀都是由數量性狀控制的，研究這些數量性狀的遺傳機制對于水稻遺傳育種具有非常重要的意義。用于數量性狀基因位點定位的群體包括傳統定位群體和次級群體。傳統定位群體主要包括F2、F3、BC1、DH、RILs等，是將2個遺傳差異很大的原始親本相互雜交而建立的分離群體，其特點是全基因組均發生分離，但QTL之間存在較復雜的互作和個體間遺傳背景的干擾。次級群體主要包括染色體片段代換系、近等基因系、導入系等，是在傳統群體的基礎上，通過回交結合分子標記輔助選擇構建的群體，其特點是與其受體親本之間只存在導入片段的差異，從而可以消除群體內遺傳背景的干擾，將復雜性狀分解為簡單性狀。Yano等[16]利用日本晴和Kasalath雜交后不同的后代群體控制水稻抽穗QTL進行研究，發現次級群體檢出的目標抽穗期QTL數量多于傳統的定位群體，究其原因主要是由于遺傳背景的干擾，大效應QTL對小效應QTL的掩蓋作用，傳統的定位群體很難檢測到效應小的QTL；另一個原因可能是因為QTL上位性互作效應的影響；次級群體在相似的遺傳背景下對數量性狀的QTL進行分析，消除了大部分遺傳背景的干擾，提高了分析的靈敏度，檢出了較多的QTL。

在利用次級群體進行抽穗期QTL精細定位和克隆研究方面，周勇等[17]利用染色體單片段代換系及其衍生群體將精細定位在第8染色體上的S8111和S849之間約59.9 kb的區間內。Pei等[18]利用染色體單片段代換系構建的F2及其衍生群體將定位在第8染色體上的RM22492 和 P23之間26 kb區間內。Wang等[19]利用染色體單片段代換系及其衍生的分離群體將精細定位在第4染色體上的WB05和WB06之間約20.7 kb的區間內，該區間內共有3個候選基因。Yano等[20-21]利用日本晴為受體親本，Kasalath為供體的近等基因系構建分離群體，精細定位并克隆了編碼產物包含395個氨基酸，含有鋅指結構域，是擬南芥帶有鋅指結構域的家族的一員。在以日本晴為受體親本，Kasalath為供體親本的高世代回交群體中精細定位并克隆了抽穗期QTL，編碼酪蛋白激酶CK2的α亞基，日本晴的等位基因可以看作是一個自然發生的座位上的CK2α無效突變。與水稻光周期敏感性有關，來自Kasalath的等位基因在長日照和自然生長條件下延遲水稻抽穗，而在短日照下則不能延遲水稻抽穗[22-23]。Hori等[24]分別利用日本晴、Koshihikari為受體，Koshihikari和日本晴為供體構建了抽穗期QTL，編碼酪蛋白激酶CKI，長日條件下通過磷酸化，從而增強其功能來下調和其下游基因如和的轉錄水平，最終延遲開花。[25]利用以Kitaake為背景導入PA64S片段的38個近等基因系克隆到抽穗期QTL。控制水稻光周期敏感性和谷粒產量的主效遺傳位點，編碼一個PRR(pseudo-response regulator)蛋白，其表達受到光周期調控。

染色體片段代換系大大提高了QTL定位的準確性和精確性，但由于分子標記數目的有限性和染色體雙交換的客觀存在，基于分子標記檢測來確定代換系的遺傳背景和代換片段的信息總是有限的，有可能造成QTL定位的誤差。隨著新一代測序技術的快速發展，通過全基因組重測序，準確鑒定染色體片段代換系的遺傳背景和代換片段的信息，繪制基于染色體片段的覆蓋基因組的Bin-map圖譜，實現QTL精確定位。

本實驗室對秈稻品種9311為受體、粳稻品種日本晴為供體構建的128個染色體片段代換系進行高通量全基因組重測序，根據測序物理圖譜及代換片段的切割信息，繪制了包含401個Bin的代換片段Bin-map圖譜，利用該套重測序的染色體片段代換系群體準確定位了8個粒形相關的QTL和14個劍葉形態相關的QTL[26-27]。本研究利用這個染色體片段代換系群體在揚州和南京2個環境，不同年份對水稻抽穗期進行鑒定，定位了6個在不同地區和年度間穩定表達的抽穗期QTL，并將他們界定到具體的染色體區段上。根據整合分子標記的物理圖譜，對本研究定位到的抽穗期QTL與前人研究結果進行比較，發現與王軍等[7]定位的抽穗期QTL、Lee等[28]定位的抽穗期QTL在同一染色體區段上；與王軍等[7]定位的抽穗期QTL在相同的染色體區段上；與王軍等[28]定位的抽穗期QTL、何鳳華等[10]定位的抽穗期QTL、張永生等[29]定位的抽穗期QTL、Pei等[18]定位的抽穗期QTL在相同或位置相近的染色體區段上。與前人相比，利用重測序構建的染色體片段代換系Bin-map圖譜可以將QTL定位在更小的區段內，本研究中的6個抽穗期QTL被定位在45~760 kb的區段內，其中被定位在第2染色體上約45 kb區間內；被定位在第3染色體上約148 kb區間內；被定位在第5染色體上約213 kb區間內，這充分證明了重測序染色體片段代換系群體在QTL鑒定和定位方面的優勢。利用帶有目標QTL的染色體片段代換系與受體親本9311雜交，構建F2及其衍生分離群體，有望快速實現這些QTL的精細定位和克隆，為進一步探明抽穗期QTL的調控機制奠定基礎。

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Mapping of QTLs for Heading Date Using Whole-genome Re-sequenced Chromosome Segment Substitution Lines in Rice

WANG Jun1,2, ZHU Jinyan2, TAO Yajun1, ZHOU Yong1, FAN Fangjun2, LI Wenqi2, WANG Fangquan2, ZHONG Weigong2, YANG Jie2,*, LIANG Guohua1,*

(1Jiangsu Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops/Key Laboratory of Plant Function Genomics, Ministry of Education Yangzhou University, Yangzhou 225009, China;2Institute of Food Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Nanjing Branch of Chinese National Center for Rice Improvement, Nanjing 210014, China;*Corresponding author, E-mail: ricegb@yzu.edu.cn)

【Objective】Heading date is an important agronomic trait in rice, it is a typical quantitative trait controlled by multiple genes. As novel research material, chromosome segment substitution lines are useful in QTL fine mapping and cloning because of minimizing the interference of genetic background among plants. 【Method】In this study, 128 whole-genome re-sequenced chromosome segment substitution lines derived from Nipponbare as donor parent in the background of 9311, were used for mapping QTLs for heading date by combining the sequencing-based Bin-map with multiple linear regression analysis. 【Result】Six QTLs for heading date were identified in two environments and two years.was mapped in the region of 759848 bp on the chromosome 2;was mapped in the region of 45286 bp on the chromosome 2;was mapped in the region of 147931 bp on the chromosome 3;was mapped in the region of 213351 bp on the chromosome 5;was mapped in the region of 442305 bp on the chromosome 5;was mapped in the region of 538176 bp on the chromosome 8. 【Conclusion】The results are important for the QTLs cloning and providea foundation for understanding molecular regulation mechanism of heading date in rice.

rice; chromosome segment substitution lines; re-sequenced; heading date

10.16819/j.1001-7216.2017.7017

Q343.1+5; S511.01

A

1001-7216(2017)04-0364-07

2017-02-08；

國家973計劃資助項目(2013CBA01405)；公益性行業科研專項(201303102)；江蘇省現代農業重點研發項目(BE2015355，BE2015341); 揚州市農業前瞻性研究資助項目(YZ2014165)。

修改稿收到日期：2017-03-08。