水稻干尖線蟲的環介導恒溫擴增技術(LAMP)快速檢測方法

白宗師 秦萌 趙立榮 韓玉春 王東偉 徐春玲 謝輝, *

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水稻干尖線蟲的環介導恒溫擴增技術(LAMP)快速檢測方法

白宗師1秦萌2趙立榮3韓玉春4王東偉1徐春玲1謝輝1, *

(1華南農業大學農學院植物線蟲研究室/植物檢疫線蟲檢測與防疫研究中心，廣州 510642；2全國農業技術推廣服務中心，北京100125；3廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心植物檢疫實驗室，廣州510623；4海南出入境檢驗檢疫局熱帶植物隔離檢疫中心，海口 570311；*通訊聯系人，E-mail：xiehui@scau.edu.cn)

【目的】本研究旨在為水稻干尖線蟲(Christie, 1942)的快速檢測鑒定和早期診斷提供一個新的檢測方法。【方法】利用水稻干尖線蟲18S核糖體RNA基因，設計了水稻干尖線蟲LAMP的特異引物，該引物包括1對外引物、1對內引物和1對環引物，以LAMP特異引物對待測樣品DNA進行恒溫擴增，擴增產物通過電泳法和熒光染料法進行檢測，電泳檢測出現階梯狀條帶或加入熒光染料顯現綠色熒光，則證明待檢樣品中含有水稻干尖線蟲。【結果】本方法可以檢測鑒定水稻干尖線蟲不同蟲態（雌蟲、雄蟲、幼蟲或卵）的個體，可以從多種線蟲混合的樣品和植物組織樣品中直接檢測出水稻干尖線蟲，檢測靈敏度達到1/1000條蟲DNA。【結論】本檢測方法具有準確、靈敏、穩定和結果直觀的優點，且操作簡便、實用性強。

水稻干尖線蟲；LAMP；快速檢測；靈敏度

水稻干尖線蟲(Christie, 1942)是一種寄生在植物地上部，并引起危害的一種葉線蟲，最初在草莓上發現，之后發現該線蟲導致水稻發生干尖病。水稻干尖線蟲能寄生200多種植物，每年為害水稻造成約16億美元的嚴重損失[1]。水稻干尖線蟲是種傳作物病原線蟲，廣泛分布于世界大多數水稻種植區[2-3]，造成水稻田間產量損失10%~30%，為害嚴重的減產高達50%以上[4-5]。在20世紀40年代，水稻干尖線蟲由日本傳入中國。在20世紀50－60年代，我國水稻干尖線蟲病發生嚴重，被列為檢疫線蟲[6]，后因采取嚴格檢疫和種子處理措施，該病害在20世紀80年代基本受到控制。但是近10多年，該病害的發生范圍和為害嚴重度又開始加大，目前在我國主要稻區均有分布，局部地區發生和為害嚴重[2, 7-10]。

水稻干尖線蟲的形態學鑒定主要根據雌蟲的體長、側線數、后陰子宮囊長、尾部形態和雄蟲的交合刺長[11]。這些特征需要用高倍顯微鏡才可以觀察到，并且卵和幼蟲均不適用于用形態學方法鑒定。此外，水稻干尖線蟲所隸屬的滑刃屬()有100多個種，蟲體都非常細小，長度通常只有0.2～1.3 mm，根據形態學特征鑒定大量相似的滑刃屬線蟲的種類非常困難[12]。因此，研究和使用分子生物學方法快速準確地檢測鑒定水稻干尖線蟲是非常有必要的。目前已有根據水稻干尖線蟲的rDNA-ITS序列，設計水稻干尖線蟲的特異性引物，利用PCR技術對水稻干尖線蟲進行分子鑒定的方法[13]，該方法具有準確、靈敏的優點，但仍然存在著一定的限制。比如需要用精密的PCR儀，檢測過程復雜、時間較長，結果必須通過瓊脂糖凝膠電泳檢測才可以判定，不能滿足口岸和調運檢疫以及田間監測的需求。

環介導恒溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplication, LAMP)是2000年開發的一種新型循環恒溫擴增技術[14]。該技術具有特異性強、靈敏度高、擴增速度快、對實驗設備要求低以及檢測結果易于觀察等特點[15]。LAMP技術的出現為病原微生物的檢測提供了一種方便快捷的途徑[16-21]。目前已報道將LAMP應用于檢測松材線蟲()[22-23]、象耳豆根結線蟲()[24]、禾谷胞囊線蟲()[25]、香蕉穿孔線蟲()[26]、北方根結線蟲()[27]和蘋果根結線蟲()[28]等植物線蟲。本研究基于水稻干尖線蟲的18S核糖體RNA基因設計了對該種線蟲進行LAMP的特異引物，并利用所設計的LAMP引物研究建立了具有特異性強、穩定性好、靈敏度高和可操作性強的水稻干尖線蟲LAMP檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試線蟲和植物材料

供試線蟲包括26個水稻干尖線蟲()種群(表1)和菊花葉枯線蟲()種群，以及滑刃屬線蟲未定種1(sp. 1)、滑刃屬線蟲未定種2(sp. 2)、松材線蟲()、水稻潛根線蟲()、南方根結線蟲()和香蕉穿孔線蟲()。其中，除了水稻潛根線蟲和滑刃屬線蟲未定種種群是直接從華南農業大學實驗田中采集土壤分離獲得以外，其他線蟲均是本實驗室培養保存。新鮮胡蘿卜購買于市場，水稻葉片采集于田間。

1.1.2 供試試劑及配制

LAMP試劑盒、鈣黃綠素、SYRB Green Ⅰ熒光染料及其他相關試劑均購自廣州東勝生物科技有公司，軟體動物DNA微量提取試劑盒購自Magen公司，植物組織DNA提取試劑盒(Omega)購自廣州邁發生物科技有限公司，引物的合成由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。

本研究使用的熒光染料為鈣黃綠素，鈣黃綠素與錳離子配比參照張躍偉等[29]，終濃度為0.05mmol/L鈣黃綠素和0.6mmol/L錳離子。將鈣黃綠素溶液(1mmol/L)和MnCl2溶液(1mmol/L)以體積比1∶12的比例混合配制成熒光染料。反應前將4 μL熒光染料加在離心管蓋的內側，LAMP反應結束后，搖動離心管將蓋上的染料混入擴增產物，顯現綠色熒光為陽性，顯現橙色（與反應前顏色相同）為陰性。

1.2 方法

1.2.1 水稻干尖線蟲的培養

胡蘿卜愈傷組織的制備主要參照陳淳等[30]和Reise等[31]的方法制備，水稻干尖線蟲的消毒和接種參照裴艷艷等[32]和彭曉放等[33]的方法。

1.2.2 DNA的提取

單條線蟲DNA提取參照王江嶺等[34]的方法，混合蟲態線蟲的微量DNA提取參照Magen公司的軟體動物組織DNA提取試劑盒(HiPure Mollusc DNA Mini Kit)說明書進行操作。混有水稻干尖線蟲植物組織的DNA提取參照Omega公司的植物DNA提取試劑盒(HP Plant DNA Kit)說明書進行。

1.2.3 水稻干尖線蟲LAMP引物設計、擴增和檢測

為了得到LAMP引物，本研究在NCBI上下載水稻干尖線蟲18S核糖體RNA基因序列(GenBank登錄號：JF826519.1)，通過Primer Premier 5軟件設計水稻干尖線蟲18S核糖體RNA基因的PCR引物，對其進行PCR擴增，將擴增產物進行測序和比對確定其序列。然后基于該基因序列通過LAMP引物在線設計網站(http://primerexplorer.jp/e/)設計獲得一對LAMP引物。利用該引物，在恒溫條件下對供試樣品DNA進行擴增。水稻干尖線蟲LAMP反應體系為2.5 μL 10×Thermopol緩沖液、1 μL F3/B3(25×)、1 μL FIP/BIP(25×)、1 μL LB/LF(25×)、6 μL dNTPs (10 mmol/L)、1.5 μL MgSO4(100 mmol/L)、1 μL Bst2.0 Warmstart DNA聚合酶(8 U/μL)、1 μL 模板 DNA、4 μL 甜菜堿和6 μL ddH2O(引物25倍混合液包括40 μmol/L FIP、40 μmol/L BIP、5 μmol/L F3、5 μmol/L B3、10 μmol/L LB和10 μmol/L LF)。LAMP反應條件如下：65℃下溫育60min，80℃保溫 10min。LAMP擴增產物的檢測方法為瓊脂糖凝膠電泳法和熒光染料直觀目測法。瓊脂糖凝膠電泳檢測方法：使用1%瓊脂糖凝膠在5~10 V/cm 電壓下電泳25 min檢測LAMP擴增產物，出現LAMP特征性階梯狀條帶，證明有水稻干尖線蟲。熒光染料直觀目測檢測方法：在LAMP擴增產物中加入4 μL熒光染料，可觀察到綠色熒光，證明有水稻干尖線蟲。

1.2.4 水稻干尖線蟲LAMP特異性、穩定性和靈敏性檢測

用香蕉穿孔線蟲、松材線蟲、潛根線蟲、南方根結線蟲和滑刃屬線蟲作為對照測試水稻干尖線蟲LAMP引物的特異性；用26個水稻干尖種群作為水稻干尖線蟲LAMP特異引物的穩定性測試對象；用電泳法及熒光染料法檢測反應結果；將單條線蟲的DNA梯度濃度稀釋液進行LAMP擴增，分別按1×100、1×101、1×102、1×103、1×104、1×105梯度進行稀釋，檢測反應靈敏度。每個處理進行3次重復。

1.2.5 混合樣品中水稻干尖線蟲的LAMP檢測

混合樣品檢測包括水稻干尖線蟲與植物組織混合樣品DNA的LAMP檢測以及水稻干尖線蟲和對照線蟲混合樣品DNA的LAMP檢測。水稻干尖線蟲與植物組織混合樣品檢測：用軟體動物組織DNA提取試劑盒(Hipure Mollusc DNA Mini Kit)和植物DNA提取試劑盒(HP Plant DNA Kit )方法提取水稻干尖線蟲與植物組織混合樣品DNA并進行LAMP擴增反應。混合樣品處理為30條水稻干尖線蟲和20 mg水稻葉片組織混合的DNA，陰性對照處理為不包含水稻干尖線蟲的水稻葉片組織DNA，設置空白對照處理，每個處理重復3次。

水稻干尖線蟲和對照線蟲混合樣品DNA的LAMP檢測包括以下處理：(1)空白對照；(2)菊花葉枯線蟲、松材線蟲、水稻潛根線蟲、南方根結線蟲、香蕉穿孔線蟲和滑刃屬線蟲的混合樣品DNA；(3)水稻干尖線蟲、菊花葉枯線蟲和松材線蟲的混合樣品DNA；(4)水稻干尖線蟲、水稻潛根線蟲和南方根結線蟲的混合樣品DNA；(5)水稻干尖線蟲、香蕉穿孔線蟲和滑刃屬線蟲未定種的混合樣品DNA；(6)水稻干尖線蟲、菊花葉枯線蟲、松材線蟲和水稻潛根線蟲的混合樣品DNA；(7)水稻干尖線蟲、南方根結線蟲、香蕉穿孔線蟲和滑刃屬線蟲未定種的混合樣品DNA；(8)水稻干尖線蟲、松材線蟲、水稻潛根線蟲、南方根結線蟲和香蕉穿孔線蟲的混合樣品DNA。每個處理中的每種線蟲均為單條線蟲，每個處理進行3次重復。

2 結果與分析

2.1 水稻干尖線蟲LAMP引物設計及檢測

用水稻干尖線蟲的18S核糖體RNA基因的PCR引物對水稻干尖線蟲DNA進行擴增，將擴增產物進行連接測序后得到1080 bp的片段，經過序列比對后，證明其和水稻干尖線蟲的18S核糖體RNA基因序列一致。基于該序列，通過LAMP引物在線設計網站設計一組水稻干尖線蟲LAMP引物，該組引物包括外引物對F3(5’-CGGTATTTTGC GCGTTTTCG-3’)和B3(5’-TCGCTACGGTCCTCG AATT-3’)；內引物對FIP(5’-TTCAGTCGTAAGAC CCGCCTTGGTCGGTGATGCGCAGGAT-3’) 和BIP(5’-CAAGGTTGCGG CCGAGTTTTATTGCGC AGCGATACGAATGC-3’)；環引物對LF(5’-T GAA ACTTGCCGAATTCACGA-3’)和LB(5’-GGTT TTG TCGGCTGAAACAATG-3’)。用設計的引物序列對供試線蟲DNA進行LAMP擴增，擴增產物經電泳檢測結果(圖1)顯示，水稻干尖線蟲2個種群的DNA樣品出現了明顯的梯狀條帶，而菊花葉枯線蟲的DNA樣品和空白對照皆未出現條帶。因此，確認所設計的引物可以作為水稻干尖線蟲的LAMP引物。

M－標記 DL2000；1－空白對照；2－水稻干尖線蟲JZ種群；3－水稻干尖線蟲HN-2種群；4和5－菊花葉枯線蟲種群。

Fig. 1. Electrophoresis detection results of amplified products ofwith LAMP specific primers.

2.2 水稻干尖線蟲LAMP引物特異性和穩定性檢測

以水稻干尖線蟲作為測試靶標線蟲，以香蕉穿孔線蟲、松材線蟲、水稻潛根線蟲、南方根結線蟲和滑刃屬未定種線蟲作為對照線蟲，測試水稻干尖線蟲LAMP引物的特異性。所有供試線蟲的DNA用水稻干尖線蟲LAMP引物擴增后的產物分別經電泳法和熒光染料法檢測，結果顯示(圖2)，只有水稻干尖線蟲的DNA樣品出現特異條帶(圖2-A)，且加入熒光染料后顏色變為綠色熒光(圖2-B)，6種對照線蟲DNA樣品未出現特異條帶，加入熒光染料后也未變色。因此，設計的水稻干尖線蟲LAMP引物具有很好的特異性。

A－LAMP擴增產物電泳檢測結果；B－LAMP擴增產物熒光染料反應結果；M－標記 DL2000；CK－空白對照；1－水稻干尖線蟲；2－松材線蟲；3－水稻潛根線蟲；4－南方根結線蟲；5－香蕉穿孔線蟲；6－滑刃屬線蟲未定種1；7－滑刃屬線蟲未定種2。

Fig. 2. Specificity detection results of amplified products ofwith LAMP primers.

A－LAMP擴增產物電泳檢測結果；B－LAMP擴增產物熒光染料反應結果；M－標記 DL2000；CK－空白對照；1~26分別為水稻干尖線蟲HM5種群、G27種群、X8種群、YQ1種群、N54種群、N71種群、N80種群、N47種群、YQ3種群、N28種群、G7種群、A-1種群、N65種群、S-2種群、X10種群、GB種群、Hq-2種群、HB種群、JZ種群、J12種群、Xi種群、HN-2種群、HC6種群、N51種群、S24種群、N10種群。

Fig. 3. Stability detection results of amplified products ofwith LAMP primers.

A和C－LAMP擴增產物電泳檢測結果；B和D－LAMP擴增產物熒光染料反應結果；M－標記 DL2000；CK－空白對照；A和B： 1－菊花葉枯線蟲；2~4－水稻干尖線蟲單條雄蟲；5~7－水稻干尖線蟲單條雌蟲；C和D： 1~3－水稻干尖線蟲單個卵；4~6－水稻干尖線蟲單條幼蟲。

Fig. 4. Detection results ofat different development stages with LAMP primers.

A－LAMP擴增產物電泳檢測結果；B－LAMP擴增產物熒光染料反應結果；M－標記 DL2000；CK－空白對照；1－水稻干尖線蟲未稀釋單條蟲DNA；2~6－10-1倍、10-2倍、10-3倍、10-4倍和10-5倍單條蟲DNA。

Fig. 5. Sensitivity detection results ofwith LAMP primers.

A－LAMP擴增產物電泳檢測結果；B－LAMP擴增產物熒光染料反應結果；M－標記 DL2000；CK－空白對照；1－不含水稻干尖線蟲的水稻葉組織；2－水稻干尖線蟲和水稻葉組織混合樣品。

Fig. 6. Detection results of mixed sample of rice leaf tissue andwith LAMP primers.

用26個水稻干尖線蟲種群進行水稻干尖線蟲LAMP特異引物穩定性測試。所有線蟲樣品的DNA進行LAMP擴增后的產物分別經電泳法和熒光染料法檢測，均出現了階梯狀條帶(圖3-A)和綠色熒光(圖3-B)，在種內表現出了很好的穩定性。

采用水稻干尖線蟲LAMP引物對水稻干尖線蟲單條(個)雌蟲、雄蟲、幼蟲和卵的DNA樣品進行LAMP擴增后的產物分別經電泳法和熒光染料法檢測(圖4)，均分別出現梯狀電泳條帶(圖4-A、4-C)和綠色熒光(圖4-B、4-D)，空白和陰性對照均未出現特異條帶和綠色熒光。因此，設計的水稻干尖線蟲LAMP引物和反應體系可以用來檢測這水稻干尖線蟲不同發育時期的單條線蟲或單個卵。

2.3 水稻干尖線蟲LAMP引物靈敏度檢測

將水稻干尖線蟲單條蟲的DNA濃度梯度稀釋液進行LAMP擴增，擴增后的產物分別進行電泳和加入熒光染料。結果表明(圖5)，水稻干尖線蟲的單條蟲DNA模版稀釋1×103倍后仍然可以擴增出清晰的電泳條帶(圖5-A)，加入熒光染料后則顯現綠 色熒光(圖5-B)。因此，建立的水稻干尖線蟲LAMP方法的檢測靈敏度為10-3條線蟲DNA。

2.4 植物組織和多種線蟲混合樣品和的水稻干尖線蟲LAMP檢測

水稻干尖線蟲與水稻葉片組織混合樣品的DNA以及水稻干尖線蟲與其他7種植物線蟲混合樣品的DNA分別進行LAMP擴增，產物分別進行電泳和加入熒光染料，結果表明(圖6和7)，含有水稻葉組織的樣品和多種線蟲混合樣品均出現明顯的特異條帶(圖6-A和7-A)，擴增產物的顏色變為綠色熒光(圖6-B和7-B)。因此，建立的水稻干尖線蟲LAMP檢測方法可以直接檢測鑒定水稻葉組織樣品和多種線蟲混合樣品中的水稻干尖線蟲。

A－LAMP擴增產物電泳檢測結果；B－LAMP擴增產物熒光染料反應結果；M－標記 DL2000；CK－空白對照；1－菊花葉枯線蟲、松材線蟲、水稻潛根線蟲、南方根結線蟲、香蕉穿孔線蟲和滑刃屬線蟲未定種的混合樣品；2－水稻干尖線蟲、菊花葉枯線蟲和松材線蟲的混合樣品；3－水稻干尖線蟲、水稻潛根線蟲和南方根結線蟲的混合樣品；4－水稻干尖線蟲、香蕉穿孔線蟲和滑刃屬線蟲未定種的混合樣品；5－水稻干尖線蟲、菊花葉枯線蟲、松材線蟲和水稻潛根線蟲的混合樣品；6－水稻干尖線蟲、南方根結線蟲、香蕉穿孔線蟲和滑刃屬線蟲未定種的混合樣品；7－水稻干尖線蟲、松材線蟲、水稻潛根線蟲、南方根結線蟲和香蕉穿孔線蟲的混合樣品。

Fig. 7. Detection results of mixed sample of control plant parasitic nematodes tissue andwith LAMP primers.

3 討論

線蟲的18S核糖體RNA是比較保守的一段序列，在種間具有較好的區分度。因此，本研究根據水稻干尖線蟲的18S核糖體RNA基因設計了特異LAMP引物。用該引物對水稻干尖線蟲以及形態和生物學特性相對近似的2個目6個屬7種其他植物線蟲進行了檢測，只有水稻干尖線蟲DNA樣品的檢測結果顯示陽性；用該引物對來自不同地區或寄主植物的26個水稻干尖線蟲群體進行LAMP檢測，所有種群的檢測結果都出現了陽性。因此設計的水稻干尖線蟲LAMP引物具有非常好的特異性和穩定性。由于本研究設計的水稻干尖線蟲LAMP引物中的1對外引物和1對內引物對水稻干尖線蟲18S核糖體RNA序列中的6個不同區域進行識別擴增，若6個區域中的任何區域與引物不匹配都不能進行核酸擴增，因此，相對于PCR引物只對靶序列的2個不同區域進行識別擴增而言，水稻干尖線蟲LAMP檢測的特異性大大提高，假陽性的概率則隨之大大降低，因此檢測的準確性提高。

本研究建立的水稻干尖線蟲LAMP檢測方法分別對水稻干尖線蟲的單條雄蟲、單條雌蟲、單條幼蟲和單個卵進行了檢測，結果均為陽性。所用檢測時間僅需1h，并且檢測靈敏度達到1/1000單條蟲DNA。而傳統的形態學檢測鑒定需要幾天時間，并且需要多條雌蟲[12]；已報道的水稻干尖線蟲PCR檢測方法則需要數小時，并且只檢測了一條線蟲DNA[13]。因此，本研究的檢測方法速度更快、靈敏度更高。本研究建立的水稻干尖線蟲LAMP檢測方法還可以檢測混有不同種類的線蟲樣品中和植物組織樣品中的水稻干尖線蟲，省去了傳統形態學鑒定和已有PCR檢測方法所要求的樣品分離步驟，從而節省了大量時間和工作量。本研究建立的LAMP結果熒光染料檢測方法，只需恒溫水浴鍋或有穩定熱源的設備就能進行，用肉眼觀察顏色變化就可判定結果，省去了昂貴的儀器設備和繁瑣的操作過程。因此本研究的檢測效率大大提高，操作簡單、易行。

本研究建立的水稻干尖線蟲LAMP檢測方法，實用性強，應用性廣，可以廣泛應用于口岸和調運檢疫以及田間監測中對水稻干尖線蟲的檢測，為水稻干尖線蟲的進出境檢疫和調運檢疫以及田間病害早期診斷和監測提供了準確、快速和易行的方法，對提高水稻干尖線蟲的檢出率和防控效果具有重要意義。

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Loop-mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Diagnosis of

BAI Zongshi1, QIN Meng2,ZHAO Lirong3, HAN Yuchun4, WANG Dongwei1, XU Chunling1, XIE Hui1, *

(Laboratory of Plant Nematology and Research Center of Nematodes of Plant Quarantine,,,,;National Agro-Technical Extension and Service Centre，，；,,,;HainanEntry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,,;Corresponding author,:..)

【Objective】This study was performed to provide a new method for the rapid detection and early diagnosis of. 【Method】The loop-mediated isothermal amplification (LAMP) specific primers ofwere designed based on the nematode18S ribosomal RNA gene, including two external primer, two inner primer and two loop primer. The DNA sample was amplified by LAMP primers using isothermal amplification. The amplified products were detected by electrophoresis and fluorescent dye. It proved that there wasin the test sample if there was clear DNA ladder in the electrophoresis results or it showed green fluorescence in the fluorescent dye results. 【Result】The results showed that LAMP primers could detect and identify single egg, juvenile, female and male of, and could also directly detectfrom multiple nematode species samples and plant tissue samples, the sensitivity of LAMP assay was 1/1000 of single nematode DNA. 【Conclusion】This diagnosis method has the advantages of accuracy, sensitivity, stability and intuitive results, and is also simple and more practical.

; LAMP; rapid diagnosis; sensitivity

10.16819/j.1001-7216.2017.7001

S435.112+.9

A

1001-7216(2017)04-0432-09

2017-01-04

國家自然科學基金資助項目(31371920)。

修改稿收到日期：2017-03-29