純化水微生物限度檢測法的優(yōu)化

孫琳琳++++++王海亮++++++劉益明++++++盧會芬++++++吳國強

[摘要] 目的 建立更為科學合理的純化水微生物限度檢測法。 方法 采用薄膜過濾法，檢驗量分別為1 mL和10 mL，培養(yǎng)基分別選用營養(yǎng)瓊脂、玫瑰紅鈉瓊脂、平板計數(shù)瓊脂、R2A培養(yǎng)基，對純化水樣進行微生物限度檢查。 結(jié)果 采用10 mL薄膜過濾法，R2A平板培養(yǎng)基進行純化水的微生物限度檢查，菌體檢出率高于其他方法1～2倍，菌落培養(yǎng)效果好。 結(jié)論 確認了最優(yōu)化的檢驗量和檢驗用培養(yǎng)基，建立了能更準確反映純化水質(zhì)量的檢測方法。該研究有利于純化水檢測方法的改進和純化水質(zhì)量控制水平的提高。

[關鍵詞] 純化水；微生物限度檢查；薄膜過濾法；檢驗量

[中圖分類號] R927 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）06（c）-0004-03

[Abstract] Objective To establish a more scientific and reasonable purified water microbial limit test method. Methods Membrane filtration method （sample quantity： 1 mL and 10 mL） were used to do the test， and nutrient agar， rose bengal agar medium， plate count agar and R2A medium were used to demonstrate the microbiology separately. Results Membrane filtration method （sample quantity： 10 mL） and R2A were better than the routine method and the other medium with a much higher occurrence of total aerobic plate count. The detection rate was 1-2 times higher than the rate of other method and medium. Conclusion The selected testing sample quantity and culture medium are optimal， and the optimized test method will reflect the real quality of the purified water. The study will provide support for the testing improvement and quality control level.

[Key words] Purified water； Microbial limit test； Membrane filtration method； Sample quantity

《中國藥典》2010版、2015版純化水微生物限度檢查中要求使用薄膜過濾法進行檢查[1-2]，但未對薄膜過濾法的檢測量等進行明確規(guī)定。目前常被采用薄膜過濾法檢驗量1 mL。已有研究表明，薄膜過濾法1 mL和平板計數(shù)法1 mL兩種方法的檢測結(jié)果一致，無明顯差異[3]，可見采用1 mL檢驗量并不能體現(xiàn)薄膜過濾法的優(yōu)勢。故薄膜過濾法1 mL的檢測方法符合性、嚴謹性不夠。

《歐洲藥典》[4-5]、《美國藥典》[6-7]和《英國藥典》[8-9]對純化水檢測方法有不同的規(guī)定和側(cè)重點。目前，大部分出口歐美市場的制藥企業(yè)，均會按照目標出口國的國家藥典要求進行純化水檢測，但對于這些檢測方法的樣品檢驗量，國內(nèi)未見研究[10]。

本試驗在分析2010～2012年三個年度純化水微生物限度檢測報告的基礎上，擬以自制純化水為研究對象，基于中國和歐美藥典的方法，對比研究了不同方法和培養(yǎng)基的檢測效果，明確了最佳檢驗量，同時明確了更靈敏的培養(yǎng)基，建立了更科學的純化水檢測方法。該方法的建立對于提高純化水微生物限度檢查的有效性、真實性和簡便性具有重要的現(xiàn)實意義，并與國際標準接軌。

1 材料和設備

1.1 材料

純化水（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司）。

1.2 試劑及培養(yǎng)基

氯化鈉（天津大茂化學試劑廠）；磷酸二氫鉀（天津科密歐化學試劑有限公司）；磷酸氫二鈉（天津博迪化學試劑廠）；蛋白胨培養(yǎng)基（北京三藥科技開發(fā)公司）；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（縮寫NA，北京三藥科技開發(fā)公司）；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（縮寫RBA，北京三藥科技開發(fā)公司）；平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（縮寫PCA，青島海博生物技術公司）；酵母蛋白胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（縮寫R2A，青島海博生物技術公司，德國默克）。

1.3 設備

TW-STV3A型薄膜過濾器（瑞安市圖班生物技術設備），XGL.GWX-0.36B型脈動真空蒸汽滅菌器（山東新華醫(yī)療器械），F(xiàn)D240型干熱滅菌烘箱（德國賓德），S20K型pH計（梅特勒-托利多儀器），PL202-S型電子天平（梅特勒-托利多儀器），AVC-4A1型垂直凈化工作臺（安斯克生物技術設備公司，ESCO），BD240型恒溫培養(yǎng)箱（德國賓德）。

2 實驗方法

2.1 檢驗量的對比研究

分別取1 mL和10 mL的純化水，采用《中國藥典》2015年版（CP2015）四部中的薄膜過濾法進行其微生物限度檢查[2]。

取少量pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液注入過濾杯中，以濕潤濾膜。濕潤濾膜后取10 mL或1 mL純化水樣及20～30 mL的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，過濾，取出濾膜，薄膜菌面朝上，分別置于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，細菌35℃，培養(yǎng)3 d，霉菌/酵母菌23℃，培養(yǎng)5 d[2]（作者已按照企業(yè)操作規(guī)程對該方法進行方法學驗證）。菌落計數(shù)器計數(shù)。

2.2 培養(yǎng)基檢測效力的對比研究

采用《美國藥典》USP-38（USP38）、《歐洲藥典》EP7.0（EP7.0）、《英國藥典》BP2015（BP2015）和CP2015中規(guī)定的薄膜過濾法[4，6，8]，設定檢測量為10 mL，分別使用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基PCA和R2A培養(yǎng)基進行檢測培養(yǎng)。具體操作方法同“2.1”項下方法，取濾過后薄膜，分別置于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、平板計數(shù)培養(yǎng)基和R2A瓊脂培養(yǎng)基的平板表面進行培養(yǎng)，計數(shù)。

3 實驗結(jié)果

3.1 檢驗量對比研究的實驗結(jié)果

不同檢測量的純化水微生物檢測結(jié)果見表1。通過實驗可以看出，對于1 mL檢驗量的薄膜過濾法，19個水點的微生物限度質(zhì)量均良好，只有2個水點檢測出微生物污染，且菌落數(shù)少，檢出率低（2/19），未發(fā)現(xiàn)任何不良趨勢。對于10 mL檢驗量的薄膜過濾法，菌體檢出率較高（7/19），是1 mL檢驗量時菌體檢出率的3.5倍，5、10、15、18和19號水點均反映輕微微生物侵染，能夠更好地反映純化水的微生物限度情況。13號水點微生物污染程度接近警戒線，便于發(fā)現(xiàn)不良趨勢，及時采取針對純化水系統(tǒng)清潔維護的整改措施?？梢?，薄膜過濾法具有較好的集菌效果，10 mL的純化水檢測量適合于純化水的微生物限度檢查，樣本代表性較好，菌體檢出率高，能夠更加準確和真實地反映純化水質(zhì)量，保證純化水系統(tǒng)的持續(xù)、穩(wěn)定、有效運行。

3.2 培養(yǎng)基培養(yǎng)效力對比研究的實驗結(jié)果

使用不同培養(yǎng)基進行微生物限度檢測的實驗結(jié)果，見表2。通過以上實驗可以看出，對于相同樣本，使用營養(yǎng)瓊脂和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板檢測和使用PCA培養(yǎng)基平板檢測的微生物檢出率較低（前者共有21個水點未檢出菌體，后者共有18個水點未檢出菌體），檢出情況基本一致，差異量均≤1 cfu/10 mL。并且使用營養(yǎng)瓊脂與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基檢測需要制備兩張濾膜，工作量較大。而采用R2A瓊脂進行菌落計數(shù)，操作相對簡單，每個水點只需要制備一張濾膜即可，并且菌體檢出率較高，共計14個水點微生物限度檢出（結(jié)果均<3 cfu/mL），每個水點的菌體檢出量均較多，最大差異量體現(xiàn)在：0622-08樣品，R2A培養(yǎng)基（檢出量21 cfu/10 mL）高于營養(yǎng)瓊脂和玫瑰紅鈉瓊脂（檢出量10 cfu/10 mL）約1倍；0622-19樣品，R2A培養(yǎng)基（15 cfu/10 mL）高于營養(yǎng)瓊脂和玫瑰紅鈉瓊脂（5 cfu/10 mL）約2倍。可見，R2A瓊脂培養(yǎng)基具有較高的靈敏性，更適合于純化水中微生物限度的檢測。

4 討論

USP、EP、BP和CP中均規(guī)定采用薄膜過濾法進行純化水微生物限度檢查，但對于純化水的檢驗量都未明確規(guī)定，要求各單位根據(jù)實際用水情況和所安裝純水系統(tǒng)性能自定檢驗量[10]。純化水水質(zhì)是決定檢驗量的基礎，通過本文的系統(tǒng)實驗表明當前大多企業(yè)為追求操作簡單只選定1 mL作為檢驗量是有所局限的，這個量并不能真實反映純化水的質(zhì)量，也不利于純化水系統(tǒng)的監(jiān)測和維護。

純化水微生物限度年度質(zhì)量回顧和趨勢分析是確定檢驗量的重要依據(jù)，本研究基于石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司3年來大量的純化水分析數(shù)據(jù)，找到了較合適的檢驗量，供讀者參考應用。

實驗中發(fā)現(xiàn)使用營養(yǎng)瓊脂和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果與使用PCA培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果基本一致，可能只檢出了水樣含菌總數(shù)的一部分，未能完全反映水樣中微生物的存在情況，這與顧孔珍等[11]的報道一致。R2A培養(yǎng)基屬于低營養(yǎng)類培養(yǎng)基，其營養(yǎng)成分較廣泛，能促進受損細菌的恢復性再生長，更適用于純化水的檢測。這將避免由于培養(yǎng)基靈敏度不夠而造成的純化水質(zhì)量不良趨勢無法被發(fā)現(xiàn)的情況，能夠及時準確地反映純化水系統(tǒng)運行情況，及時維護，延長系統(tǒng)壽命。

本文研究所確定的方法可大大提高純化水微生物限度檢測的有效性，有利于生產(chǎn)和檢驗中純化水質(zhì)量的控制。同時，也為其他制藥企業(yè)建立合適的純化水微生物限度法提供參考和指導。

[參考文獻]

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