miR—21表達(dá)量與動脈粥樣硬化程度的關(guān)系及長春西汀對其影響

王珊++++++楊華昱++++++姚蘭++++++汪云超++++++陳海平++++++馬清

[摘要] 目的 研究不同程度動脈粥樣硬化與miR-21表達(dá)量的相關(guān)性，以及應(yīng)用長春西汀后對miR-21表達(dá)量的影響。 方法 選取2014年1月～2016年12月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院醫(yī)療保健中心住院的動脈粥樣硬化患者40例，按動脈粥樣硬化程度將其分為輕度（9例）、中度（6例）和重度（25例），按治療方法將其分為用藥組（17例）和對照組（23例）。提取患者的血清RNA并利用實(shí)時定量PCR方法分析不同程度動脈粥樣硬化患者血清中miR-21水平，比較用藥組和對照組治療前后miR-21含量和血細(xì)胞比容的變化。 結(jié)果 重度動脈粥樣硬化患者血清miR-21表達(dá)水平明顯高于輕度動脈粥樣硬化患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。治療后，用藥組血細(xì)胞比容、miR-21相對含量均較治療前明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），用藥組和對照組治療后miR-21相對含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 動脈粥樣硬化患者血清miR-21水平隨動脈粥樣硬化程度的增高而增高，經(jīng)長春西汀治療后，miR-21表達(dá)水平明顯下調(diào)，提示miR-21與動脈粥樣硬化程度相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 長春西汀；動脈粥樣硬化；微小RNA

[中圖分類號] R541.4 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）06（c）-0161-04

[Abstract] Objective To study the correlation between different degrees of atherosclerosis and the expression quantity of miR-21， and the influence of Vinpocetine application on the expression quantity of miR-21. Methods Forty patients with atherosclerosis hospitalized in Medical Care Center， Beijing Friendship Hospital， Capital Medical University from January 2014 to December 2016 were selected， and they were divided into mild （9 cases）， moderate （6 cases） and severe （25 cases） according to the degree of atherosclerosis， and they were also divided into medication group （17 cases） and control group （23 cases） according to the treatment method. The serum RNA of patients was extracted and the levels of serum miR-21 in the patients with different degrees of atherosclerosis were analyzed by real-time quantitative PCR， the changes of miR-21 and haematocrit before and after treatment in the medication group and control group were compared. Results The expression of miR-21 in patients with severe atherosclerosis was higher than that in patients with mild atherosclerosis， the difference was statistically significant （P < 0.05）. After treatment， the haematocrit and relative contents of miR-21 in the medication group were lower than those before treatment， the differences were statistically significant （P < 0.05）， there was no statistically significant difference of the relative contents of miR-21 after treatment between medication group and control group （P > 0.05）. Conclusion The levels of serum miR-21 in patients with atherosclerosis are increased with the increase of atherosclerosis， and the expression of miR-21 is significantly decreased after treatment with Vinpocetine， which indicates that miR-21 has correlation with atherosclerosis.

[Key words] Vincristine； Atherosclerosis； MicroRNA

動脈粥樣硬化以動脈壁的脂質(zhì)沉積、功能紊亂及斑塊形成、慢性炎癥細(xì)胞浸潤為主要特征，是公認(rèn)的一種慢性炎癥疾病[1]，其預(yù)防與治療是目前心腦血管專家關(guān)注的焦點(diǎn)之一[2]。miR-21是一類非編碼RNA，其作為原癌基因在多種腫瘤中高表達(dá)，并參與細(xì)胞的增生、分化、凋亡等過程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[3]。而近期有研究表明，miR-21在腦梗死、冠心病等動脈粥樣硬化相關(guān)性疾病中表達(dá)明顯增高[4-5]。長春西汀具有抑制血小板聚集、降低血液黏度、改善血液微循環(huán)和流動性等作用[6-8]，且可改善大動脈粥樣硬化。本研究著眼于明確動脈粥樣硬化程度與miR-21含量之間的關(guān)系，以及應(yīng)用長春西汀后對miR-21表達(dá)量的影響，為研究miR-21表達(dá)水平對動脈粥樣硬化程度的評估和發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月～2016年12月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院醫(yī)療保健中心住院的動脈粥樣硬化患者40例。研究對象均在住院期間接受腦血流圖以及頸動脈、鎖骨下動脈、雙下肢動脈B超檢查，存在1條或1條以上動脈粥樣硬化的患者即納入研究對象。按照所累積的血管數(shù)量將動脈粥樣硬化程度分為輕度（9例）、中度（6例）和重度（25例），輕度是指存在2條或2條以下大動脈粥樣硬化，中度是指存在3～4條大動脈粥樣硬化，重度是指存在4條以上大動脈粥樣硬化，或有冠心病、下肢動脈閉塞。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有重大疾病，比如惡性腫瘤、嚴(yán)重心腦血管疾病、需要進(jìn)行重大器官移植手術(shù)、深度昏迷、永久性癱瘓、嚴(yán)重腦損傷等；體檢項(xiàng)目（包括肝腎功能、血常規(guī)、腹部B超、胸部X線片等）中提示肝腎功能不全等異常的患者。按照治療方法的不同將患者分為對照組（23例）和用藥組（17例），兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。見表1。

1.2 治療方法

對照組給予阿司匹林，100 mg/次，1次/d，口服。用藥組在對照組的基礎(chǔ)上增加長春西汀注射液（匈牙利吉瑞大藥廠，10 mg/支，批號A9A017B），首劑量為20 mg/次，1次/d，第2天開始為30 mg/次，1次/d，均加入0.9%氯化鈉注射液250 mL，靜脈滴注。兩組患者均治療14 d。治療前后均用EDTA采血器抽取5 mL靜脈血，收集血清，分裝于EP管保存于-80℃冰箱中。

1.3 主要儀器與試劑

實(shí)時定量PCR儀型號為ABI 7500。RNA提取所用TRIzol購自Invitrogen公司；mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Transgene公司；天根公司的miRcute Plus miRNA定量PCR檢測試劑盒（SYBR Green）（貨號：FP411）；miR-21及對照的引物序列購買自Invitrogen公司，序列見表2，其中U6為對照。

1.4 血清RNA的提取與實(shí)時定量PCR檢測

1.4.1 RNA提取 從-80℃冰箱中取出血清樣本，冰上溶解后，提取300 μL加入1 mL TRIzol，室溫放置5 min。之后加入0.2 mL三氯甲烷震蕩30 s，室溫1 min。將樣品于4℃離心機(jī)中，12 000 r/min離心30 min。吸取上層水相加入等體積異丙醇，混勻后于-20℃沉淀10 h。之后4℃，12 000 r/min，離心30 min。棄掉上清，用1 mL 75%的預(yù)冷乙醇洗沉淀2次，棄掉上清后將EP管置于室溫使殘留的乙醇揮發(fā)，使沉淀干燥。加入適量的DEPC水（30～40 μL）溶解沉淀，取適量RNA進(jìn)行瓊脂糖電泳觀察條帶，并用分光光度儀測RNA濃度。

1.4.2 逆轉(zhuǎn)錄過程 使用Transgene公司EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒，按照說明書進(jìn)行操作。逆轉(zhuǎn)錄體系如下：RNA 500 ng～2 μg，2×TS緩沖液10 μL，TSII緩沖液1 μL，OligodT試劑1 μL，無核酸酶水補(bǔ)至20 μL。運(yùn)行RT程序：42℃，30 min；85℃，5 min；4℃，10 min。

1.4.3 實(shí)時定量PCR反應(yīng) 使用Takara公司的SYBR預(yù)混試劑及ABI7500定量PCR儀進(jìn)行定量PCR，以人snRNA U6（Human snRNA U6）為內(nèi)參。實(shí)時定量PCR反應(yīng)體系：PCR預(yù)混試劑10 μL，RT模板1 μL，引物（上下游各10 μmol/L）1 μL，50×ROX DYE Ⅱ 0.4 μL，無菌去離子水7.6 μL。程序如下：95℃預(yù)變性10 s；95℃變性5 s，60℃退火延伸34 s，重復(fù)40個循環(huán)，然后進(jìn)行溶解曲線分析。采用相對定量方法對實(shí)時定量PCR的結(jié)果進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組計(jì)量資料比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩組計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同程度動脈粥樣硬化患者基線資料與miR-21含量比較

重度動脈粥樣硬化患者動脈粥樣硬化指數(shù)（AI）、血細(xì)胞比容、miR-21相對含量均明顯高于輕度動脈粥樣硬化患者（P < 0.05），而高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）則明顯低于輕度動脈粥樣硬化患者，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表3。

2.2 對照組和用藥組治療前后血細(xì)胞比容和miR-21相對含量的變化比較

治療前對照組和用藥組血細(xì)胞比容以及miR-21相對含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。治療后，用藥組血細(xì)胞比容、miR-21相對含量均較治療前明顯下降（P < 0.05），對照組組內(nèi)治療前后血細(xì)胞比容、miR-21相對含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。治療后，對照組和用藥組血細(xì)胞比容以及miR-21相對含量比較，差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表4。

3 討論

隨著老齡化社會進(jìn)程的加快，我國動脈粥樣硬化的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢[9]，同時，由于動脈粥樣硬化是心腦血管突發(fā)事件的主要原因，因此對動脈粥樣硬化的程度進(jìn)行詳細(xì)評估、針對性治療和療效評估意義重大，其可大大降低動脈粥樣硬化疾病和心腦血管突發(fā)事件的發(fā)病率[10]。研究表明[11-12]，動脈粥樣硬化形成機(jī)制主要包括脂質(zhì)浸潤、氧化應(yīng)激、慢性炎性反應(yīng)與損傷、血小板聚集以及血栓形成等，其中血管內(nèi)皮損傷是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[13]。

microRNA在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要的調(diào)控作用，其中miRNA對內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)以及與血管內(nèi)皮損傷之間的關(guān)系成為研究熱點(diǎn)之一[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)[16]，miR-21通過激活NO產(chǎn)生的通路影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)功能，從而調(diào)控血管的損傷修復(fù)與新生。同時microRNA在各種因素造成的血管內(nèi)皮損傷中，可調(diào)節(jié)血管活性物質(zhì)和細(xì)胞因子水平[如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素（IL）等]，從而調(diào)控炎性反應(yīng)的程度及損傷程度[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致白細(xì)胞增加及NF-κB表達(dá)上調(diào)，促使TNF-α、IL-6、IL-8等炎性因子的釋放，從而通過影響機(jī)體炎性反應(yīng)影響動脈粥樣硬化形成[19-20]。

本研究發(fā)現(xiàn)根據(jù)動脈粥樣硬化程度進(jìn)行輕度、中度、重度分類后，通過分析研究對象的基線資料，發(fā)現(xiàn)反映血液黏稠度的血細(xì)胞比容與AI、HDL-C水平，均與動脈粥樣硬化程度有明顯相關(guān)性，血細(xì)胞比容水平越高，則動脈粥樣硬化程度越重，而HDL-C水平越高時動脈粥樣硬化程度越輕。通過實(shí)時定量PCR檢測miR-21含量后發(fā)現(xiàn)，miR-21的相對含量與動脈粥樣硬化程度呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），說明miR-21水平、血細(xì)胞比容、AI、HDL-C水平可反映動脈粥樣硬化的程度。之后，本研究應(yīng)用長春西汀治療動脈粥樣硬化后發(fā)現(xiàn)，規(guī)范應(yīng)用長春西汀14 d后患者的血細(xì)胞比容明顯下降，miR-21相對含量的變化與血細(xì)胞比容相同，說明長春西汀具有改善血液黏稠度的效果，同時能降低miR-21的含量以及血細(xì)胞比容，其結(jié)果說明長春西汀可影響動脈粥樣硬化的程度，具有改善動脈粥樣硬化的療效。

綜上所述，動脈粥樣硬化患者血清miR-21可作為判斷動脈粥樣硬化程度的一種血液標(biāo)志物，同時能部分反映動脈粥樣硬化治療后的效果。但本研究樣本量偏小，且為單中心實(shí)驗(yàn)，同時關(guān)于miR-21對動脈粥樣硬化的作用機(jī)制未進(jìn)行深入探索，故待下一步擴(kuò)大樣品量以及于細(xì)胞水平、分子水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。總之，本研究發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化患者血清miR-21水平與動脈粥樣硬化程度呈正相關(guān)，且經(jīng)長春西汀治療后miR-21表達(dá)水平明顯下調(diào)，說明miR-21具有一定的療效評估作用以及臨床診斷價值。

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