三七皂苷在JNK介導的低氧高二氧化碳性肺動脈高壓模型中的機制探討

周小雄++++++葉桃春++++++羅川晉++++++吳輝++++++褚慶民++++++趙新軍

[摘要] 目的 研究JNK信號通路在大鼠低氧高二氧化碳性肺動脈高壓（HHPH）發生發展中的動態變化，探討三七皂苷（PNS）防治HHPH的機制。 方法 復制慢性HHPH的SD大鼠模型，分為正常組（N，n=10），低O2高CO2組（H4w，n=10）及PNS治療組（Hp4w，n=10）。RT-qPCR及Western blot檢測JNK mRNA及蛋白表達情況。原代培養SD大鼠肺動脈平滑肌細胞（PASMCs），取2～5代對數生長期細胞，分為正常組（N）、低O2高CO2組（H）及PNS治療組（R10、R50、R100），PNS治療組分別用不同濃度（10、50、100 mg/L）的三七皂苷單體R1進行處理，24 h后收集細胞，RT-qPCR及WesternBlot檢測JNK mRNA及蛋白表達情況。然后用R1及JNK抑制劑SP600125分別及聯合處理PASMCs 5 d，CCK8檢測細胞增殖情況。 結果 ①與N組相比，H4w組和Hp4w組mPAP均明顯增高（P < 0.05），同時Hp4w組mPAP明顯低于H4w組（P < 0.05）。②肺組織JNK mRNA在H4w組中表達最高，N組最低，Hp4w組介于兩組之間（均P < 0.05）；p-JNK蛋白在H4w組較N組高表達（P < 0.05），Hp4w組較H4w組下降（P < 0.05）。③PASMCs H組JNK mRNA及蛋白表達明顯高于N組（P < 0.05），與H組相比，R1（10、50、100 mg/L）不同程度抑制了JNK mRNA及蛋白表達（P < 0.05）。④PNS及SP600125處理組PASMCs均出現了明顯的增殖受抑（P < 0.05）。 結論 JNK信號通路參與了大鼠HHPH的形成。PNS可減輕這一過程，其機制可能與PNS抑制JNK的表達與激活有關。

[關鍵詞] 三七皂苷；低氧高二氧化碳；肺動脈高壓

[中圖分類號] R543.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）06（c）-0007-05

[Abstract] Objective To investigate the dynamic change of JNK signaling pathway in the occurrence and development of hypoxic hypercapnia pulmonary hypertension in rats， discuss the mechanism of panax notoginoside （PNS） in the protection of hypoxic hypercapnia pulmonary hypertension. Methods Rats pathological models of hypoxic hypercapnia pulmonary hypertension were established： SD rats were randomly divided into three groups （n=10）： normal group （N group）， hypoxic hypercapnia for 4 week group （H4w group）， and PNS-injected group （Hp4w group）. RT-qPCR and Western blot were used to detect the expression of JNK. Primary cultured PASMCs， isolated from SD rats， were incubated in logarithmic growth phase from the 2nd to 5th generation. PASMCs were divided into five groups： normal group （N group）， hypoxic hypercapnia group （H group）， and R1 treated group with different concentrations （10， 50 and 100 mg/L） of notoginsenoside monomer R1 under the condition of 6% CO2 plus 1% O2 for 24 h （R10， R50 and R100 groups）. The expressions of JNK mRNA and protein levels were detected by RT-qPCR and Western blot. PASMCs were treated with R1 and JNK inhibitor SP600125 for 5 days， CCK8 was used to detect the proliferation of PASMCs. Results ①The mPAP in H4w and Hp4w group was higher than that of N group （P < 0.05）， but mPAP in Hp4w group was obviously lower than that of H4w group （P < 0.05）. ②The mRNA and protein levels of JNK were significantly increased in H4w and Hp4w groups， compared with N group （P < 0.05）， and Hp4w group was lower than H4w group （P < 0.05）. ③The protein and mRNA expression levels of JNK in PASMCs were significantly higher in H group than those in N group （P < 0.05）； compared with H group， in R1 treatment （10， 50 and 100 mg/L） groups， the expression levels of JNK were markedly decreased （P < 0.05）. ④The proliferation of PASMCs were significantly inhibited in groups treated with R1 and JNK inhibitor SP600125 （P < 0.05）. Conclusion JNK may play an important role in the development of hypoxia induced pulmonary hypertension. The effect of PNS on reducing pulmonary hypertension and improving pulmonary vascular wall remodeling may be partly related to its inhibition of JNK pathway.

[Key words] Panax notoginoside； Hypoxic hypercapnia； Pulmonary arterial hypertension

低氧高二氧化碳性肺動脈高壓（hypoxic hypercapnia pulmonary hypertension，HHPH）以肺血管阻力增加為主要表現[1-2]。目前研究顯示，HHPH是由于肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）增殖異常，導致遠端肺動脈腔狹窄阻塞，引起肺血管的阻力增加[3-4]。因此，對于平滑肌細胞增殖的抑制或能逆轉肺動脈，改善遠端肺動脈重構，是預防和治療肺動脈高壓的關鍵措施之一。三七的主要成分三七皂苷（panax notogino side，PNS）具有調節血液循環、改善血流動力學等多種生理功能。之前研究發現，PNS的主要成分三七皂苷單體R1（notoginsenoside monomer R1，R1）能通過抑制MAPK通路延緩大鼠HHPH的形成[5]。

MAPK是一組保守的絲/蘇氨酸激酶，其家族成員包括ERK1/2、p38激酶、JNK/SAPK等，廣泛參與炎癥、癌變等生理病理過程。研究報道，R1能夠顯著降低低氧高二氧化碳條件下PASMCs中p-ERK1/2[6]、p-p38[7]的水平，從而抑制平滑肌細胞的增殖和遷移。而JNK在PASMCs中是否也起到了類似作用，尚無文獻報道。本研究通過檢測肺動脈高壓大鼠模型中JNK的活化水平，體外用PNS對PASMCs進行干預，檢測JNK通路的變化，探討PNS治療HHPH的可能作用機制，為臨床治療肺動脈高壓提供理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與藥品

SPF級雄性SD大鼠30只，體重250～300 g，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號：No.44005800002610。血塞通注射液（有效成分為PNS，昆明興中制藥廠生產，批號：20100808）、5%水合氯醛、Olympus顯微照像儀、Powerlab四道記錄儀、呼吸機、Bio-Rad化學顯像儀、Thermo Fisher Scientific ViiA7 Real-Time PCR System。胎牛血清、DMEM高糖培養基（美國Gibco公司），三七皂苷單體R1（廣州中醫藥大學醫學院有機化學教研室提供），RT-qPCR試劑盒（日本TaKaRa公司），化學發光試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒（北京鼎國昌盛生物公司），小鼠抗大鼠磷酸化JNK抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗（美國Cell Signal Technology公司），JNK抑制劑SP600125（Selleck，S1460），CCK8（Selleck）。研究符合動物實驗倫理準則。

1.2 慢性HHPH大鼠模型的復制

隨機將SD大鼠分成N、H4w和Hp4w共3組，每組10只。將H4w和Hp4w組置于低氧高二氧化碳艙內，保持O2濃度為9%～11%，CO2濃度為5%～6%，每天8 h，每周6 d。Hp4w組每日于腹腔注射血塞通注射液[50 mg/（kg·d）]，H4w組大鼠同時注射等量的生理鹽水，注射半小時后入艙。N組置于艙外，呼吸正常空氣。三組均飼養4周后進行后續實驗。

1.3 大鼠血流動力學測定

經處理4周后，對大鼠進行腹腔麻醉（腹腔注射5%水合氯醛），固定于手術臺上，行頸正中切口，于左側分離出左頸外靜脈，自左頸外靜脈插管至肺動脈，Powerlab生理記錄儀測定其平均肺動脈壓（mPAP）；右側分離出右頸總動脈，插管測量其平均頸動脈壓（mCAP）。以mPAP>15 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）作為模型建立成功的指標。

1.4 PASMCs的分離和培養

處死大鼠，在75%酒精中浸泡后取出肺葉，在超凈工作臺內解剖顯微鏡直視下取出2～4級肺動脈，剝離外膜，去除內皮細胞，將其剪碎，0.2%膠原酶Ⅰ于37℃消化30 min，后終止消化，轉入離心管中1000 r/min離心5 min，棄上清，加DMEM（20%FBS）接種至100 mm培養皿中，常規CO2培養箱中培養，觀察細胞貼壁情況及細胞形態，待血管平滑肌細胞達90%以上時，進行下一步實驗。

1.5 PASMCs藥物處理分組

將第3～5代處于對數生長期的PASMCs接種于6孔板中（5×105個/mL，2 mL/孔），采用高糖DMEM培養液+10%FBS培養，待細胞長至80%融合度時換成無血清DMEM培養基繼續培養24 h后，加藥物處理。實驗分組分為：常氧組（N）：不給予任何處理因素，氣體條件為5%CO2+21%O2，37℃孵育24 h；低氧高二氧化碳組（H）：加入PBS，氣體條件為6%CO2+1%O2，37℃孵育24 h；R1干預組（R10、R50、R100）：分別加入10、50、100 mg/mL R1，氣體條件為6%CO2+1%O2，37℃孵育24 h。

1.6 JNK mRNA表達水平檢測

取組織或細胞，加1 mL Trizol，反復吹打后再加入200 μL氯仿，劇烈震蕩15 s后靜置，4℃ 12 000 r/min離心15 min，轉移上層水相，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，靜置5 min，4℃ 12 000 r/min離心10 min。棄上清，加入1 mL 75%乙醇，4℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清，晾干后加入適量DEPC水溶解。逆轉錄RNA合成cDNA。qPCR檢測JNK mRNA表達豐度。反應條件為：94℃預變性2 min；94℃變性15 s，60℃ 延伸60 s，40個循環。實驗結果以GAPDH為內對照，計算ΔΔCT值，進行分析。GAPDH（Rat）上游序列：5′-ACT？鄄CCCATTCTTCCACCTTTG-3′，下游序列：5′-CCCTGTT？鄄GCTGTAGCCATATT-3′；JNK（Rat）上游序列：5′-AAGATCCCTGACAAGCAGTTAG-3′，下游序列：5′-TCTTAGTTCGCTCCTCCAAATC-3′。

1.7 Western blot檢測磷酸化JNK 蛋白含量

各組取組織或細胞，加入適量裂解液，裂解30 min，超聲粉碎儀充分裂解細胞后，4℃ 12 000 r/min離心15 min，吸取上清，于-80℃保存。BCA法測定蛋白濃度。電泳采用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，恒壓80 V 30 min，改120 V至溴酚藍跑到凝膠底部。PVDF膜轉膜，100 V恒流電轉90 min，后3%BSA封閉1 h，洗膜后加p-JNK抗體（CST，1∶1000），4℃孵育過夜，次日加入辣根過氧化物酶標記的二抗（Santa Cruz，1∶5000），室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，化學發光底物ECL顯色，BioRad化學發光成像系統進行顯影。

1.8 PASMCs細胞增殖能力檢測

將肺動脈平滑肌細胞（1×103個/孔）接種于96孔培養板。待細胞長至60%的融合度，棄原細胞培養液，饑餓處理24 h。分別及聯合加入R1（50 mg/ml）和JNK抑制劑SP600125（40 nmol/L），藥物處理5 d后，每孔加入10 μL CCK8，37℃繼續培養2 h，在酶標儀450 nm波長下測吸光度，計算細胞增殖情況。

1.9統計學方法

采用SPSS 21.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠平均頸動脈壓及平均肺動脈壓比較

2.1.1 各組大鼠平均頸動脈壓比較 N組、H4w組和Hp4w組大鼠組間mCAP差異無統計學意義（P > 0.05），見表1。提示低氧高二氧化碳對大鼠的體循環壓沒有影響。

2.1.2 各組大鼠平均肺動脈壓比較 H4w組和Hp4w組mPAP均高于N組，差異有統計學意義（P < 0.05），說明低氧高二氧化碳處理4周后大鼠會出現明顯的肺動脈高壓。同時，H4w組mPAP明顯高于Hp4w組（P < 0.05），提示PNS可能有利于減緩低氧高二氧化碳引起的肺動脈高壓。見表1。

2.2 各組大鼠肺組織中JNK mRNA及蛋白水平比較

2.2.1 各組大鼠肺組織中JNK mRNA水平比較 qPCR結果顯示，各組大鼠肺組織中JNK mRNA出現明顯變化，在N組中JNK mRNA水平不高，給予低氧高二氧化碳處理4周后，JNK mRNA表達顯著增加（P < 0.05），而加入PNS處理后的Hp4w組JNK mRNA明顯低于H4w組，但仍高于N組水平（P < 0.05）。見圖1。

2.2.2 各組大鼠肺組織勻漿JNK蛋白水平比較 各組肺組織勻漿p-JNK出現明顯變化，在N組中p-JNK蛋白未見表達，給予低氧高二氧化碳處理4周后，p-JNK蛋白表達顯著增強（P < 0.05），而加入PNS處理后的Hp4w組p-JNK蛋白明顯低于H4w組（P < 0.05），但仍高于N組水平。見圖2。

2.3 各組PASMCs中JNK mRNA及蛋白水平比較

2.3.1 各組PASMCs中JNK mRNA相對表達量比較 H組和R1各濃度組JNK mRNA表達水平較N組均明顯增加（P < 0.05）；R1各濃度組間JNK mRNA表達呈劑量依賴性，隨R1濃度增高，JNK mRNA表達水平次第下降，且R100組和R10組之間的JNK mRNA表達水平差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖3。

2.3.2 各組PASMCs中JNK蛋白表達量比較 N組p-JNK蛋白表達較弱，H組和R1各濃度組JNK mRNA表達水平較N組均明顯增加（P < 0.05）；R1各濃度組與H組相比，p-JNK蛋白表達水平均出現顯著下調（P < 0.05）。R1各濃度組之間p-JNK表達呈劑量依賴性，隨R1濃度增高，p-JNK表達水平次第下降，R100組和R10組間比較，差異有統計學意義（P < 0.05），二者與R50組之間比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖4。

2.4 JNK對PASMCs增殖的影響

利用CCK8測定PNS及JNK抑制劑SP600125對PASMCs增殖的影響，結果顯示，與未處理組相比，處理組均出現了明顯的增殖受抑（P < 0.05），而相比單藥處理組，PNS及SP600125聯合處理組出現了一個輕微的累加效應（P < 0.05）。見圖5。

3 討論

肺動脈高壓是慢性、嚴重的致命性疾病，可繼發于心、肺、全身性疾患或原因不明，主要表現為進行性呼吸困難，最終導致右心衰竭而死。肺動脈高壓與肺動脈內細胞的活化增殖相關。平滑肌細胞增殖和伴隨的遷移使血管介質變厚，侵入內膜并參與叢狀體的形成[8]。目前認為，低氧高二氧化碳引起HHPH主要有兩大機制[9]：①介質學說認為，低氧可以激活NO、ET等因子引起血管的收縮與舒張；②直接學說認為，低氧可直接刺激PASMCs，引起PASMCs的收縮、增殖、遷移等改變，導致肺血管阻力增加。低氧是引起PASMCs增殖的重要因素，此外，鈣內流引起的細胞內代謝紊亂也是其中原因之一[10-11]。

三七總皂苷是五加科人參屬植物三七的主要成分，具有抗炎、抗氧化、清除自由基、擴張血管、抗血小板凝集等生物學功能。有文獻報道，PNS能抑制慢性缺氧大鼠內皮細胞NO的合成與釋放，進而延緩慢性低氧性肺動脈高壓的進程[12]。目前認為，三七皂苷是一種鈣拮抗劑，能夠通過抑制MAPK 通路來減輕肺動脈高壓的程度，而其主要成分單體R1具有相似的作用[6-7]。

本實驗結果顯示，HHPH模型鼠加用PNS藥物治療后，其mPAP出現顯著降低，而mCAP未發生明顯改變，提示PNS可能延緩HHPH的進程，而不造成體循環的改變，即PNS對HHPH具有選擇性抑制作用。同時，H4w組大鼠肺組織中JNK mRNA水平出現明顯改變，JNK表達顯著增加；而加入PNS后的Hp4w組相較于H4w組，JNK mRNA表達水平顯著下降，其磷酸化活性也出現明顯降低，提示JNK可能參與了肺動脈高壓的形成，而PNS則通過部分阻斷JNK通路的活化，而達到降低肺動脈高壓的目的。體外研究表明，在低氧高二氧化碳條件下，肺動脈平滑肌細胞在加用低、中、高劑量R1處理后，其p-JNK蛋白表達均明顯低于未加藥組。PNS處理組PASMCs增殖速率明顯下降，而PNS與JNK抑制劑聯合處理組出現協同效應，提示除JNK通路外，PNS可能還參與了其他信號通路的調節。

目前研究顯示，在HHPH大鼠模型中肺小血管的重塑與JNK/MAPK通路的激活密切相關[13-15]。MAPK通路的激活介導了肺動脈高壓過程中PASMCs的增殖[16-18]，然而究竟是什么引起了MAPK通路的激活、p38及JNK的磷酸化，繼而促進了細胞的增殖失控，尚不清楚。有研究推測，缺氧內環境及持續的鈣內流鈣超載可能是引起MAPK通路激活的原因[19-20]。PNS作為一種鈣拮抗劑，可能由此參與了MAPK通路的調節，而PNS在MAPK激活過程中是怎樣參與其中，JNK、p38等分子又是怎樣調節PASMCs增殖的，目前尚不明確。此外，PNS是否還有其他的作用機制，能否通過調節其他信號通路來達到延緩肺動脈高壓的目的，尚需進一步研究。

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