1，25（OH）2D3對(duì)人白血病6T—CEM細(xì)胞株凋亡及VDR蛋白表達(dá)的影響

古麗巴哈·買(mǎi)買(mǎi)提++++++劉玉++++++趙莉++++++嚴(yán)媚

[摘要] 目的 探討1，25-二羥維生素D3[1，25（OH）2D3]對(duì)人白血病6T-CEM細(xì)胞株凋亡及維生素D受體（VDR）蛋白表達(dá)的影響。 方法 培養(yǎng)6T-CEM細(xì)胞株，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為A、B、C、D四組，A、B、C組分別加入濃度為10-6、10-7、10-8 mol/L的1，25（OH）2D3，D組加入DMSO。采用MTT法檢測(cè)各組吸光度A值和細(xì)胞增殖抑制率情況，AO-EB熒光染色觀察各組細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，RT-PCR和Western blot法檢測(cè)VDR mRNA和蛋白表達(dá)。 結(jié)果 A組吸光度A值明顯低于B、C組和D組（P < 0.05）；A、B、C三組的細(xì)胞增殖抑制率從高到低依次排序?yàn)锳>B>C；D組CEM細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯低于A、B、C組（P < 0.05）；A組凋亡指數(shù)明顯高于其他三組（P < 0.05）；各組VDR mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；A組VDR蛋白表達(dá)明顯高于其他三組（P < 0.05）。 結(jié)論 1，25（OH）2D3能有效抑制6T-CEM細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，上調(diào)VDR蛋白表達(dá)。

[關(guān)鍵詞] 白血病；6T-CEM細(xì)胞株；1，25-二羥維生素D3；維生素D受體

[中圖分類(lèi)號(hào)] R733.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）06（c）-0012-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of 1， 25-dihydroxyvitamin D3 [1， 25 （OH）2D3] on apoptosis of 6T-CEM cell lines and expression of vitamin D receptor （VDR） protein human leukemia. Methods The 6T-CEM cell lines were cultured and randomly divided into group A， B， C， D. Group A， B， C were added with 1， 25 （OH）2D3 with the concentration of 10-6， 10-7， 10-8 mol/L respectively， and group D was added with DMSO. The absorbance A value and cell proliferation inhibition rate were detected by MTT method， the cell morphology was observed by AO-EB fluorescence staining， and the cell apoptosis was detected by flow cytometer， the expression of VDR mRNA and protein were detected by RT-PCR and Western blot method. Results The absorbance of group A was apparently lower than that of group B， C and D （P < 0.05）； the inhibitory rate of cell proliferation of group A， B， C was A>B>C； the CEM cell apoptosis index of group D was apparently lower than that of group A， B and C （P < 0.05）； the apoptosis index of group A was apparently higher than other three groups （P < 0.05）； there was no statistically significant difference in VDR mRNA expression among the four groups （P > 0.05）. The VDR protein expression of group A was apparently higher than that of other three groups （P < 0.05）. Conclusion 1， 25 （OH）2D3 can effectively inhibit the proliferation of 6T-CEM cells， induce its apoptosis， up-regulate the VDR protein expression.

[Key words] Leukemia； 6T-CEM cell lines； 1， 25-dihydroxyvitamin D3； Vitamin D receptor

白血病是一種惡性的造血干細(xì)胞克隆性疾病，也是目前最為常見(jiàn)和最具威脅的血液系統(tǒng)疾病[1-2]。該病的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，一般認(rèn)為與多個(gè)基因的調(diào)控異常有關(guān)[3]。目前臨床上多采用基因靶向藥物治療慢性粒細(xì)胞白血病，雖然取得了一定的效果，但其分子靶點(diǎn)具有一定的局限性，對(duì)一些急變期慢性粒細(xì)胞白血病患者的治療效果較差[4-5]。1，25-二羥維生素D3[1，25（OH）2D3]是維生素D在機(jī)體中主要的活性產(chǎn)物，不但具有調(diào)節(jié)鈣磷代謝平衡的作用，還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化并抑制腫瘤細(xì)胞增殖，其目前是腫瘤研究的熱點(diǎn)之一[6-7]。本研究選取人白血病6T-CEM細(xì)胞株作為研究對(duì)象，探討分析了1，25（OH）2D3對(duì)人白血病6T-CEM細(xì)胞株凋亡及維生素D受體（VDR）蛋白表達(dá)的影響，為臨床上尋找更好的分子靶點(diǎn)治療白血病提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株6T-CEM由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所提供，置于-80℃冰箱中保存。培養(yǎng)方法如下：將菌株取出后于37℃迅速融化，以1000 r/min離心（離心半徑為3 cm）5 min后棄上清液，利用培養(yǎng)液洗滌后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行重懸，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每2～3天換液并傳代1次。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

將CEM細(xì)胞懸液密度調(diào)整為2.0×105/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，采用隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)分為A、B、C、D四組，A、B、C組分別加入以DMSO稀釋的濃度為10-6、10-7、10-8 mol/L的1，25（OH）2D3各100 μL，D組加入100 μL DMSO，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖

取各組細(xì)胞懸液加入MTT（5 mg/mL）孵育4 h，隨后加入DMSO進(jìn)行溶解并沉淀，利用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸光值（A），每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖抑制率=（對(duì)照孔平均OD值-用藥孔平均OD值）/對(duì)照孔平均OD值×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 AO-EB染色觀察細(xì)胞形態(tài)

取各組細(xì)胞懸液加吖啶橙和溴化乙啶（AO-EB）染液進(jìn)行復(fù)合染色，并于3 min內(nèi)以熒光顯微鏡（Axioskop40，德國(guó)Zesis公司）進(jìn)行觀察，發(fā)射波長(zhǎng)分別為紅色熒光（600 nm）和綠光（550 nm），每個(gè)視野內(nèi)隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞來(lái)計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)，公式如下：細(xì)胞凋亡指數(shù)（%）=（早期凋亡細(xì)胞+晚期凋亡細(xì)胞）/全部細(xì)胞×100%，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將各組細(xì)胞懸液以PBS洗滌后再加入體積分?jǐn)?shù)為0.7的乙醇4℃固定過(guò)夜，加入20 μg/mL的RNase，37℃條件下處理30 min，過(guò)濾后加入5 μL AnnexinV-FITC和100 μg/mL的PI染液染色30 min，最后以流式細(xì)胞儀（FACSCalibur，BD公司）進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 RT-PCR檢測(cè)VDR mRNA表達(dá)

將各組細(xì)胞懸液以RNA提取試劑盒提取總RNA，加入逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，隨后利用RT-PCR試劑盒和熒光定量PCR儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，7900FS）定量檢測(cè)VDR mRNA的表達(dá)情況，RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司，具體檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7 Western blot檢測(cè)VDR蛋白表達(dá)

將各組細(xì)胞抽提蛋白后取約50 μg于聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，2 h后轉(zhuǎn)移至聚亞乙烯雙氧化物膜上，5%脫脂奶粉孵育過(guò)夜。先加入1∶1000的一抗（Anti-VDR Ab）稀釋液于4℃條件下孵育過(guò)夜，再加入1∶5000的二抗（HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG）稀釋液于室溫下孵育1 h，加入電化學(xué)分析劑后暗室顯影和定影，采用軟件進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算VDR蛋白與β-actin的灰度比值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)整理分析采用SPSS 19.0軟件，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較使用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CEM細(xì)胞的MTT檢測(cè)情況

A組的吸光度A值明顯低于B、C、D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。A、B、C三組的細(xì)胞增殖抑制率從高到低依次排序?yàn)锳>B>C。見(jiàn)表1。

2.2 CEM細(xì)胞形態(tài)特征

AO-EB復(fù)合染色結(jié)果，細(xì)胞核或細(xì)胞漿呈致密濃染或碎片呈黃綠色熒光者即為凋亡細(xì)胞，同時(shí)細(xì)胞核呈紅色熒光者即為壞死細(xì)胞。可見(jiàn)A組正常細(xì)胞少見(jiàn)，B組正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞并存，C組可見(jiàn)少數(shù)凋亡細(xì)胞，D組細(xì)胞大小形態(tài)均一，胞核及胞漿呈均勻黃綠色熒光。見(jiàn)圖1（封三）。

2.3 CEM細(xì)胞凋亡情況

A組CEM細(xì)胞凋亡指數(shù)為（41.23±4.10）%，B組為（30.05±2.84）%，C組為（24.38±1.46）%，D組為（11.50±0.07）%，四組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。其中A、B、C組分別與D組比較，t = 13.283、10.382和9.894，P < 0.05；A、B組分別與C組比較，t = 11.034、7.382，P < 0.05；A組與B組比較，t = 9.372，P < 0.05。見(jiàn)圖2（封三）。

2.4 VDR mRNA和蛋白表達(dá)情況

各組VDR mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。A組VDR蛋白表達(dá)明顯高于其他三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表2、圖3～4。

3 討論

白血病是一類(lèi)造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，主要是指克隆性白血病細(xì)胞增殖失控、分化障礙、凋亡受阻等，并在骨髓和其他造血組織中大量累積，浸潤(rùn)其他非造血組織和器官，進(jìn)而抑制正常造血功能的疾病，患者的臨床表現(xiàn)多為不同程度的貧血、出血、感染發(fā)熱以及肝、脾、淋巴結(jié)腫大和骨骼疼痛等[8-10]。我國(guó)白血病的發(fā)病率較高，在各種腫瘤中占第6位，發(fā)病原因分為病毒、化學(xué)、放射、遺傳等因素，臨床上多依據(jù)起病的緩急分為急性和慢性白血病兩種。目前臨床上并沒(méi)有統(tǒng)一的治療方式，常用的方法有化學(xué)治療、放射治療、靶向治療、免疫治療、干細(xì)胞移植等，且已取得了良好的治療效果，患者的預(yù)后得到了明顯的改善[11]。但同時(shí)也有研究表明[12]，大劑量化療藥物治療雖然能改善患者的癥狀，但長(zhǎng)期用藥的不良反應(yīng)較大，患者的依從性也較差，因此尋找新的、特異性高、不良反應(yīng)小的藥物是目前醫(yī)學(xué)關(guān)注的重點(diǎn)和難點(diǎn)。近年來(lái)，1，25（OH）2D3抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用備受關(guān)注，已有不少學(xué)者將1，25（OH）2D3應(yīng)用于腸癌、乳腺癌細(xì)胞、急性髓性白血病等的治療過(guò)程中，并取得了一定的效果[13-16]。1，25（OH）2D3是人體必需維生素，又稱(chēng)為骨化三醇，也是維生素D在人體內(nèi)的活化形式，其不但可以維持體內(nèi)鈣環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定，還可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的增殖、分化。為了進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，本研究選取人白血病6T-CEM細(xì)胞株作為研究對(duì)象，探討分析不同濃度的1，25（OH）2D3對(duì)人白血病6T-CEM細(xì)胞株凋亡及VDR和蛋白表達(dá)的影響。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A、B、C組測(cè)得吸光度A值均明顯低于D組，且A組最低；計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率發(fā)現(xiàn)，A、B、C組細(xì)胞增殖抑制率分別為63.53%、27.27%和7.03%，提示1，25（OH）2D3對(duì)人白血病6T-CEM細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用，且隨著1，25（OH）2D3濃度的升高，抑制作用則明顯提升。將各組細(xì)胞進(jìn)行染色后觀察發(fā)現(xiàn)，A組內(nèi)幾乎全為凋亡和壞死細(xì)胞，而B(niǎo)組內(nèi)正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞并存，C組僅有少量凋亡細(xì)胞，D組內(nèi)幾乎全為正常細(xì)胞，提示1，25（OH）2D3具有誘導(dǎo)人白血病6T-CEM細(xì)胞株凋亡的作用，且隨著濃度的提升，誘導(dǎo)作用明顯加強(qiáng)，而各組CEM細(xì)胞凋亡情況也進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論。本研究中，D組CEM細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯低于A、B、C組，而A組凋亡指數(shù)為明顯高于其他三組。但本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，添加1，25（OH）2D3濃度最高的A組的凋亡指數(shù)也僅為（41.23±4.10）%，細(xì)胞增殖抑制率僅為63.53%，提示單用1，25（OH）2D3的療效較小，將1，25（OH）2D3與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用可能會(huì)提高療效，但具體結(jié)果需做進(jìn)一步的深入研究。

有研究表明[17]，1，25（OH）2D3對(duì)腫瘤的調(diào)節(jié)作用主要是通過(guò)VDR來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其與VDR特異性結(jié)合后可促進(jìn)VDR與視黃醛酸受體結(jié)合形成復(fù)合物，并與相應(yīng)基因的啟動(dòng)子區(qū)域作用元件進(jìn)行結(jié)合，進(jìn)而抑制該基因的轉(zhuǎn)錄活性，而靶細(xì)胞對(duì)VD反應(yīng)性的差異與VDR蛋白的表達(dá)水平相關(guān)。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，各組VDR mRNA表達(dá)差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），但A組VDR蛋白表達(dá)為0.612±0.042，明顯高于其他三組，提示不同濃度的1，25（OH）2D3對(duì)VDR mRNA表達(dá)并無(wú)明顯影響，但能調(diào)控VDR蛋白的表達(dá)，且隨著濃度的升高，效果更為明顯。

本研究選用人白血病6T-CEM細(xì)胞株作為研究對(duì)象，對(duì)比了不同濃度的1，25（OH）2D3對(duì)人白血病6T-CEM細(xì)胞株凋亡及VDR和蛋白表達(dá)的影響，證實(shí)了1，25（OH）2D3能抑制CEM細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，其作用機(jī)制可能與上調(diào)VDR蛋白的表達(dá)有關(guān)，這與文獻(xiàn)的研究結(jié)果基本一致[18]。但也有研究表明[19-20]，1，25（OH）2D3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡與多種基因如C-myc、Bcl-2、TNF等的調(diào)控有關(guān)；本研究限于研究樣本的不足，對(duì)于其作用機(jī)制仍需作進(jìn)一步的深入研究。

綜上所述，1，25（OH）2D3能有效抑制6T-CEM細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，上調(diào)VDR蛋白表達(dá)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 王潔，葉芳，李國(guó)霞，等.急性髓細(xì)胞性白血病基因表達(dá)特點(diǎn)分析[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016，13（1）：13-16.

[2] 程平，張東華.成人高危急性髓系白血病的治療進(jìn)展[J].臨床血液學(xué)雜志，2015，28（2）：259-264.

[3] 陳瑩瑩，曾慶曙.TKI治療慢性粒細(xì)胞白血病慢性期的新目標(biāo)轉(zhuǎn)換[J].安徽醫(yī)藥，2014，18（11）：2021-2024.

[4] 蔣明，陳文聰，鄭多.BCR-ABL融合基因在慢性粒細(xì)胞白血病臨床診治中的研究進(jìn)展[J].中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志，2016，44（3）：356-360.

[5] 南虎松，劉紅.伊馬替尼治療不同分期慢性粒細(xì)胞白血病的療效及影響因素分析[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2015， 25（4）：72-74.

[6] 顧磊，徐慶，曹暉.1，25-二羥基維生素D3對(duì)Th17細(xì)胞調(diào)控的研究進(jìn)展[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2015，31（24）：4141-4142.

[7] 曹義娟，徐惠，權(quán)斌，等.5種藥物對(duì)乳腺癌細(xì)胞分化和增殖抑制作用的比較[J].腫瘤學(xué)雜志，2016，22（6）：452-456.

[8] 王愿，高曉晗，郝洪嶺.CD44與抗白血病效應(yīng)的研究進(jìn)展[J].國(guó)際腫瘤學(xué)雜志，2015，42（3）：235-237.

[9] 滕文靜，周超，秦寶寧，等.從活血化瘀類(lèi)中藥探討骨髓造血干細(xì)胞“小生境”CXCR4-CXCL12軸平衡與慢性粒細(xì)胞白血病[J].遼寧中醫(yī)雜志，2015，42（6）：1159-1161.

[10] 張嵐.長(zhǎng)鏈非編碼RNA與白血病的研究進(jìn)展[J].山西醫(yī)藥雜志，2016，45（4）：415-419.

[11] 邱錄貴.慢性淋巴細(xì)胞白血病治療模式的轉(zhuǎn)變[J].中華血液學(xué)雜志，2014，35（4）：275-277.

[12] 張旗，慕俐君，李偉平，等.大劑量阿糖胞苷治療急性髓細(xì)胞白血病療效及不良反應(yīng)觀察[J].醫(yī)學(xué)與哲學(xué)，2016， 37（2）：44-46.

[13] 胡萍萍，房棟，陳淼.1，25-二羥基維生素D3增強(qiáng)多柔比星對(duì)胃癌細(xì)胞株的殺傷作用[J].腫瘤，2016，31（4）：304-309.

[14] 吳玉，衛(wèi)紅艷，翟瓊莉.1，25（OH）2D3對(duì)成骨細(xì)胞增殖及其與乳腺癌細(xì)胞黏附的影響[J].山東醫(yī)藥，2014，54（39）：1-4.

[15] 趙紅偉，韓華，岳月紅.1，25-二羥基維生素D3對(duì)腸黏膜屏障的保護(hù)作用及機(jī)制探討[J].山東醫(yī)藥，2016，56（34）：14-16.

[16] 王赟，歐渤苒，洪海波，等.急性白血病患者不同時(shí)期血清25-羥維生素D3水平的比較[J].醫(yī)學(xué)臨床研究，2016， 33（10）：2021-2022.

[17] 蔣普.1，25二羥基維生素D3對(duì)肺癌的抑制作用[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2013，10（8）：998-1000.

[18] 鄭敏，何云燕，羅建明.1，25-二羥維生素D3對(duì)白血病6T-CEM細(xì)胞株作用的體外研究[J].廣西醫(yī)學(xué)，2013， 35（6）：730-731.

[19] 彭昌能，谷苗，李國(guó)慶.1，25（OH）2D3用于抗腫瘤的研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2010，12（10）：127-130.

[20] 周敏，郭銀鳳，宋志霞，等.1，25（OH）2D3通過(guò)VDR-PPARγ通路促使高糖誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)換[J].中華腎臟病雜志，2015，31（6）：440-450.