8周跑臺訓練對肥胖小鼠血管內皮細胞胰島素PI3K/Akt通路的影響

李 娟，沈江振，陳 巍，唐東輝

（1.燕山大學體育學院，河北 秦皇島 066004；2.河北科技師范學院體育系，河北 秦皇島 066004；3.北京師范大學體育與運動學院，北京 100875）

8周跑臺訓練對肥胖小鼠血管內皮細胞胰島素PI3K/Akt通路的影響

李 娟1，沈江振2，陳 巍2，唐東輝3

（1.燕山大學體育學院，河北 秦皇島 066004；2.河北科技師范學院體育系，河北 秦皇島 066004；3.北京師范大學體育與運動學院，北京 100875）

目的：探討運動鍛煉對肥胖小鼠血管內皮細胞胰島素PIK3/Akt信號通路的影響，揭示運動鍛煉降低肥胖者心血管病風險的相關生物學機制。方法：將雄性C57BL/6小鼠隨機分為對照組（CG, n=12）與高脂膳食組（HG, n=33），肥胖模型建立后，HG隨機分為肥胖組（OG, n=11）與肥胖運動組（OEG, n=13），OEG小鼠接受8周跑臺訓練（12 m/min，60 min/ time，1 time/ d，6 d/w），記錄小鼠體重及能量攝入，免疫組織化學及western blot檢測小鼠主動脈內皮IRS1、p-IRS1（Ser307）、Akt及 p-Akt（Thr308）水平的變化。結果：1）OEG小鼠體重較OG下降（P＜0.01）；2）OEG小鼠胰島素水平及HOMA-IR較OG顯著下降（P＜0.05，P＜0.05）；3）OEG小鼠主動脈內皮p-IRS1（Ser307）表達較OG降低（P＜0.05），p-Akt（Thr308）表達較OG顯著上升（P＜0.05）。結論：8周跑臺訓練可降低肥胖小鼠體重增長，改善胰島素抵抗，促進血管內皮細胞胰島素PI3K/Akt信號通路轉導。

運動；肥胖小鼠；胰島素抵抗；血管內皮細胞; PI3K/Akt通路

由于人類生活方式發生了變化，導致肥胖（obesity）在全球范圍內普遍流行，極大促進了動脈粥樣硬化、2型糖尿病、冠心病、高血壓等心血管疾病的發病風險[1]。血管內皮功能障礙（endothelial dysfunction）是血管病變的啟動環節，幾乎與所有的心血管疾病存在密切聯系[2-3]。大量研究證實，肥胖誘導的胰島素抵抗（insulin resistance）在血管內皮功能障礙的發生過程中具有關鍵性作用[3]。生理條件下，胰島素可通過作用于血管內皮細胞上胰島素受體激活經磷酸肌醇3激酶（PIK3）/蛋白激酶B（Akt）信號通路，增加一氧化氮（NO）釋放，促進血管舒張[4]。但在肥胖狀態下，多種因素導致血管內皮細胞合成NO的能力下降，血管舒張功能減弱，進而增加上述心血管疾病罹患風險[4-5]。越來越多的研究提示，提高身體活動水平或規律的運動鍛煉可以顯著降低肥胖者心血管疾病的發病率與死亡率[6-9]，但其中的生物學機制并未完全闡明。在前期研究的基礎上，本研究主要探討8周跑臺訓練對肥胖小鼠血管內皮細胞胰島素信號調節蛋白表達及其磷酸化水平的影響，揭示運動鍛煉改善肥胖相關血管內皮功能障礙、降低心血管病風險的生物學機制。

1 實驗對象與方法

1.1 實驗對象與分組 雄性C57BL/6小鼠（6 weeks，15.62±1.45g，n=45），由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，小鼠在實驗室內分籠飼養，自由進食飲水，明暗交替周期為12h，動物房溫度為25℃±2℃，相對濕度為45%±10%。小鼠在動物房內適應性飼養3天后隨機分為2組：對照組（CG,n=12）、高脂膳食組（HG，n=33），12周后將肥胖建模成功的小鼠（n=24）再隨機分為肥胖組（OG，n=11）、肥胖運動組（OEG，n=13）。

1.2 肥胖小鼠模型的建立 適應性飼養結束后，CG小鼠進食普通飼料（2.90kcal/g,13%脂肪，64%糖，23%蛋白質）；OG與OEG小鼠進食高脂飼料（4.20kcal/g，51%脂肪，33%糖，16%蛋白質）。喂養12周后，將小鼠體重超過CG小鼠平均體重20%作為肥胖模型成功標準。剔除體重未達標的小鼠，然后，OG與OEG小鼠繼續采用高脂飼料喂養，OEG開始進行為期8周的跑臺運動干預，CG與OG小鼠不進行運動干預。

1.3 運動干預方案 運動干預采用電動跑臺訓練（成都泰盟，FT-200），跑臺坡度為0度，恒定跑速為12m/ min，每次訓練時間為60min，每日訓練1次，每周連續訓練6天，連續進行6周。

1.4 能量攝入及體重的計算 實驗期間,每日詳細記錄小鼠進食行為與攝食量，每周計算1次24h平均能量攝入量及食物消耗量。小鼠24h能量攝入量（kcal/24h）= 食物消耗量（g/24h）×食物的能量密度（kcal/g）。每24h稱量一次小鼠體重（0.1g）。

1.5 樣品采集及處理 最后一次運動結束48h后，每組取6只小鼠，用5%的水合氯醛溶液對小鼠腹腔注射（0.5 ml/10g），深度麻醉后，眼球取血，將全血放入離心管，以3500rp/min離心10min后，分離血清，分裝后置4℃環境待測；打開胸腔，分離主動脈，取結締組織，生理鹽水洗凈，取適當長度置4%多聚甲醛溶液中固定，剩余血管組織用液氮冷凍后低溫保存。

1.6 血清生化指標檢測 小鼠血糖水平采用血糖儀（OMRON,中國）檢測；胰島素水平采用ELISA法測定，操作步驟嚴格按照試劑盒（美國R&D公司）說明書進行。穩態模型評估胰島素抵抗指數（HOMA-IR），HOMAIR=空腹胰島素（mIU/L）×空腹血糖（mmol/L）/ 22.5。

1.7 免疫組織化學 將甲醛固定后的小鼠主動脈進行石蠟包埋，休塊后，以5μm的厚度切片，將其附貼于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，37℃過夜，脫蠟，蒸餾水洗3次，5%BSA封閉30min，滴加一抗孵育，4℃過夜。PBS沖洗10min×3次，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗，37℃靜置30min。PBS沖洗2min×3次；滴加試劑SABC，37℃靜置30min，PBS沖洗5min×3次，經DAB顯色后采用蘇木素輕度復染，脫水，透明，中性樹膠封片，采用Image-Pro Plus6.0軟件統計每個高倍視野內的陽性細胞的平均光密度值（average optical density, AOD）。

1.8 Western blot檢測 小鼠血管內皮組織蛋白表達采用Western blot法，將適量血管組織進行剪切后放置預冷的勻漿器充分研磨后，加入適量裂解液裂解30min，以12 000r/min離心10min取上清液分裝，BCA法測定蛋白濃度。依次上樣、電泳、轉膜、封閉，加入稀釋的單克隆抗體，孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育60min，將ECL工作液加置PVDF膜，室溫下孵育5min后用保鮮膜包好PVDF膜，經顯影、曝光、洗膜、封閉。將β-actin單克隆抗體按1∶500稀釋到一抗稀釋液中，室溫下搖動60min，按上述方法得到內參條帶，將膠片用凝膠圖象處理系統分析目標帶的分子量和凈光密度值。

1.9 統計學處理 本實驗所得的數據采用SPSS18.0軟件進行統計學分析，所有的計量資料以均數±標準差（±s）表示。各變量組間均數的比較采用方差分析（one way ANOVA），顯著性水平均為P＜0.05。

2 結 果

2.1 小鼠體重變化 從第6周開始HG小鼠體重顯著高于CG小鼠（P＜0.01）。第12周開始進行運動干預，將HG中符合肥胖標準的小鼠隨機分為OG與OEG，與OG比較，OEG小鼠從第15周開始體重顯著下降（P＜0.01）（圖1A）。

圖1 小鼠體重與能量攝入變化

2.2 小鼠能量攝入變化 HG小鼠在整個飼養過程中每日能量攝入顯著高于CG（P＜0.01）；運動干預開始后，OEG小鼠每日能量攝入在第13周、第14周均顯著高于OG（P＜0.01），從第15周至第20周每日能量攝入，兩組未見顯著差異（圖1B）。

2.3 小鼠血糖、胰島素及HOMA-IR的比較 與CG比較，OG小鼠血糖水平未見顯著變化，但胰島素水平及HOMA-IR卻顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）；與OG比較，OEG小鼠胰島素水平及HOMA-IR均顯著下降（P＜0.05，P＜0.05）（圖2）。

圖2 小鼠血糖、胰島素及HOMA-IR的比較

2.4 小鼠血管內皮細胞的IRS1與Akt表達及磷酸化水平比較 免疫組織化學結果顯示，位于血管內皮細胞層的目標蛋白的免疫陽性反應呈棕黃色染色（圖3）。與CG比較，OG小鼠血管內皮IRS1及Akt的蛋白表達未發生顯著變化，但p-IRS1的表達水平非常顯著升高（P＜0.01），而p-Akt的表達非常顯著降低（P＜0.01）；與OG比較，OEG小鼠血管內皮p-IRS1顯著降低（P＜0.05），p-Akt表達顯著增高（P＜0.05）（圖4）。

圖3 小鼠血管內皮細胞p-IRS-1及p-Akt的定位表達

圖4 小鼠血管內皮細胞IRS1、Akt的蛋白表達及磷酸化水平比較

3 討 論

伴隨著經濟社會的快速發展，肥胖在發達與發展中國家已成為影響人類健康的社會問題，也成為決定疾病模式變化的重要因素[1]。其中，胰島素抵抗是指胰島素靶組織對正常劑量的胰島素敏感性下降，即生理劑量的胰島素不能夠維持其正常的生理功能，胰島素抵抗是聯系肥胖與多種代謝異常的重要紐帶。除了經典的靶組織，如骨骼肌、脂肪及肝臟組織外，胰島素還可以通過作用于血管內皮細胞的特異性受體，激活胰島素受體底物（IRS），通過PI3K或者絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑調節血管內皮源性舒張因子與收縮因子的釋放，調控血管平滑肌舒張與收縮[4-5]。肥胖誘導的胰島素抵抗可通過引起血管內皮功能障礙，增加心血管病風險[5]。充分的證據表明，規律的運動鍛煉對降低肥胖者代謝性疾病風險具有重要的意義[6-8]。但相關生物學機制并未完全闡明。

本研究發現，肥胖小鼠的胰島素抵抗指數較正常小鼠明顯增加，血管內皮p-IRS1（Ser307）水平明顯增加，而p-Akt（Thr308）水平卻顯著下降，這提示肥胖小鼠血管內皮細胞胰島素PI3K/Akt信號途徑存在障礙。研究表明，胰島素作用于內皮細胞受體后，可通過IR/IRS/ PI3K/Akt信號通路增加一氧化氮合酶（eNOS）的活性，促進內皮細胞合成NO[9-11]。另一方面，胰島素還可作用于血管內皮細胞的MAPK通路促進內皮素（ET-1）的釋放，NO與ET-1是體內最重要的舒血管物質和縮血管物質，這兩種物質保持平衡是維持血管張力正常的重要基礎[11]。對于IRS1而言，胰島素信號轉導發生障礙后，其酪氨酸磷酸化水平會下降，而絲氨酸磷酸化水平會增加，進而導致PI3K依賴的胰島素信號通路抑制，NO合成降低，但是血管內皮細胞MAPK信號依然正常，這就造成血管內皮細胞ET-1的分泌量相對增加，最終導致血管趨向于收縮[5,12]。血管持續收縮會產生許多不良結果，一方面會使動脈血壓增加；另一方面會導致胰島素的靶組織血流灌注量降低，增加胰島素抵抗的程度[3,13]。肥胖者血管內皮功能障礙主要的原因就是血管內皮細胞NO合成減少所致[3,6]。這可能是胰島素抵抗增加肥胖人群心血管疾病風險的重要原因之一。本研究還發現，經過8周跑臺訓練后，肥胖小鼠體重增長速度與胰島素抵抗指數均顯著降低。同時還發現，8周跑臺訓練顯著降低了肥胖小鼠血管內皮細胞p-IRS1（Ser307）水平，而p-Akt（Thr308）水平卻顯著升高。這提示運動干預可促進肥胖小鼠血管內皮細胞胰島素PI3K/Akt信號轉導，改善胰島素抵抗。

目前，運動鍛煉改善肥胖相關胰島素抵抗的機制已經成為研究熱點。本研究結果提示，運動干預可顯著改善肥胖小鼠胰島素抵抗，提高血管內皮細胞胰島素信號轉導，這二者之間可能存在密切聯系。由于胰島素抵抗被認為是孕育多種代謝性疾病的“共同土壤”，因此，肥胖者應重視通過規律的運動鍛煉改善胰島素抵抗與血管內皮功能，這可能會成為肥胖者降低心血管疾病風險的重要策略。

4 結 論

8周跑臺訓練可以明顯降低肥胖小鼠體重增長，改善胰島素抵抗，同時還可以促進血管內皮細胞胰島素PI3K/ Akt信號轉導。這可能是規律運動鍛煉降低肥胖者心血管疾病風險的重要生物學機制之一。

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Effects of 8-week Treadmill Training on PI3K/Akt Pathway in Vascular Endothelial Cells of Obese Mice

LI Juan1, SHEN Jiang-zhen2, CHEN Wei2, TANG Dong-hui3
(1. College of Physical Education，Yanshan University，Qinhuangdao 066004，Hebei China；2. Department of Physical Education, Hebei Normal University of Science and Technology, Qinhuangdao 066004, Hebei China；3. P.E. and Sport College, Beijing Normal University, Beijing 100875, China)

The objective of this study is to investigate the effect of treadmill exercise on PI3K/Akt pathway of vascular endothelial cells in obese mice. Methods: male C57BL/6 mice were randomly divided into control group (CG, n=12) and high fat group (HG, n=33). HG were randomly divided into obesity group (OG, n=11) and obesity group (OEG, n=13) after obese model induced by high fat diet, OEG mice were taken treadmill exercise for 8 weeks (12 m/min, 60 min/ time, 1 time/d, 6 d/w); the body weight and energy intake were recorded, the IRS1, p-IRS1(Ser307), Akt and p-Akt (Thr308) in aortic endothelium were detected by immunohistochemistry and western blot. Results: 1) the body weight of OEG mice was lower than CG (P < 0.01). 2) The insulin level and HOMA-IR signif i cantly increased in OG (P < 0.01, P < 0.01); and insulin levels and HOMA-IR signif i cantly decreased in OEG compared with OG (P < 0.05, P < 0.01). 3) The expression of TH in VTA-NAc system was lower in OG than CG (P < 0.01); and was morein OEG than OG (P < 0.05). The expression p-IRS1(Ser307) in OEG was lower than OG (P < 0.05), and the p-Akt (Thr308) expression was more in OEG than OG (P < 0.05). Conclusion: 8-week treadmill training can decrease weight gain, improve insulin resistance, and promote insulin PI3K/Akt signaling pathway in vascular endothelial cells in obese mice.

exercise; obese mice; insulin resistance; endothelial cell; PI3K/Akt signaling

G804.2

A

1004 - 7662(2017)04- 0084- 05

2017-03-03

國家自然科學基金（項目編號：81472992）；燕山大學青年教師自主研究計劃課題資助（項目編號：14LGB030）。

李娟，講師，碩士，研究方向：運動防治肥胖生物學機制。