hsa-miR-655靶向CLCF1基因對人成骨肉瘤MG63細胞 OPG/RANKL系統表達的影響

陳娟 謝麗華 李生強 許惠娟 陳賽楠 葉云金 葛繼榮

福建省中醫藥研究院骨質疏松證候基因組學重點研究室，福建 福州 350003

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，POP)是中老年女性的常見多發病，以骨量低下、骨微結構破壞，導致骨脆性增加、易發生骨折為特征的全身性骨病，其發生與遺傳、內分泌和免疫等因素密切相關[1]。miRNAs是一類內源性、長度約19～26個核苷酸的非編碼短小RNA，對骨代謝和骨的發育重建起著重要作用[2]。課題組前期研究發現，hsa-miR-655通過靶向結合CLCF1 mRNA的3'UTR區，在轉錄后水平負性調控絕經后骨質疏松癥關聯基因CLCF1的表達[3]，但hsa-miR-655介導CLCF1基因參與POP的具體機制尚不清楚。

CLCF1是B淋巴細胞的催化劑，可刺激B細胞活化，參與體液免疫[4]。“骨免疫學”理論認為，骨骼系統與免疫系統之間存在密切關系，免疫失調可導致骨代謝異常[5]。OPG/RANKL/RANK 系統作為連接骨代謝與免疫系統之間的橋梁，是調節骨重建的一類重要的信號通路。本研究通過在人成骨肉瘤MG63細胞系中過表達hsa-miR-655，研究hsa-miR-655通過靶向調控CLCF1基因表達，對細胞增殖和骨免疫重要通路OPG/RANKL/RANK系統的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人成骨肉瘤細胞 MG63(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)；MEM培養基(GIBCO公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，GIBCO公司)；青鏈霉素(Invitrogen公司)；hsa-miR-655表達慢病毒(上海吉凱基因化學技術有限公司，貨號MI0003677)；hsa-miR-655引物、U6引物(廣州市銳博生物科技有限公司)；microRNA提取試劑盒(Qiagen公司)；miRNA反轉錄試劑盒、miRNA定量試劑盒(廣州市銳博生物科技有限公司)；Trizol試劑(Invitrogen公司)；PrimeScript 逆轉錄試劑盒(Fermentas公司)；CLCF1、OPG、RANKL引物(寶生物工程有限公司)；CLCF1、OPG、RANKL、GAPDH抗體(Abcam公司)；Cell Counting Kit-8試劑盒(日本同仁公司)；SYBR?PremixExTaqTMGC Kit(TaKaRa公司)；PCR儀(ABI 7500 Fast)；核酸檢測儀(NanoDrop 2000/2000c 分光光度計，Thermo公司)；Annexin V-PE/7-AAD雙染細胞凋亡盒、細胞周期檢測試劑盒(BD公司)；FACS Calibur流式細胞儀(BD公司)。

1.2 方法

1.2.1MG63細胞培養和慢病毒感染：MG63細胞用MEM培養基，含10%FBS、1%雙抗，置于5% CO2孵箱中37 ℃恒溫培養箱培養。轉染前先將MG63細胞接種于6孔板中，分2組：陰性對照組(NC組)和hsa-miR-655過表達組(OE組)。OE組和Vector組按照感染復數50(multiplicity of infection，MOI)，分別感染hsa-miR-655表達慢病毒及相應陰性對照慢病毒。24 h后換正常培養液，轉染72 h后熒光顯微鏡及流式細胞術(flow cytometry，FCM)觀察感染效率，并收取細胞進行相關檢測。

1.2.2實時熒光定量PCR：根據試劑盒說明分別提取細胞microRNA和總RNA。定量后利用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄獲得定量 PCR模板。引物序列見表1，熒光定量PCR反應條件如下：①預變性：95 ℃ 10 s，②變性：95 ℃ 5 s，③退火、延伸：60 ℃ 31 s，40個循環。每組均做3個重復，取均數。miR-655相對定量計算以U6作為內參，CLCF1、OPG、RANKL相對定量計算以GAPDH作為內參，采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。

1.2.3細胞增殖實驗：收集各組MG63細胞，以2×103/孔的細胞數接種于96孔板，各實驗組均設3個復孔，每孔添加培養液100 μL。分別于0、24、48、72、96 h行CCK8檢測。每孔加入CCK8試劑10 μL，避光孵育3 h。酶標儀檢測450 nm 處各孔的吸光度值(OD450)，用空白對照調零去除背景值。

1.2.4流式細胞術分析細胞周期分布：收集各組細胞，將約1×106個細胞移入離心管中，1000 rpm離心5 min，棄去上清，PBS溶液清洗一次。加入70%冰乙醇5 mL混勻固定，4 ℃放置48 h以上。檢測前加入0.5 mLPI/RNase(BD公司，貨號550825)染色液，室溫避光染色15 min，流式細胞儀檢測細胞周期時相。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.5Western blot 檢測蛋白水平：RIPA 裂解法提取轉染后各組MG63細胞總蛋白，定量蛋白濃度。40μg蛋白樣品，SDS-PAGE膠分離蛋白。采用濕轉系統，100 V恒壓轉膜60 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；分別加入CLCF1抗體(1∶1000)、OPG抗體(1∶1000)、RANKL抗體(1∶500)和GAPDH抗體(1∶2000)。4 ℃孵育過夜；1×TBST 漂洗3次，加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的二抗(1∶4000)，常溫孵育1 h；1×TBST 漂洗4次，避光條件下化學發光檢測，并進行灰度值分析。以GAPDH作為內參計算目的蛋白相對灰度比值。

2 結果

2.1 hsa-miR-655過表達后上調MG63細胞miR-655水平

慢病毒感染MG63細胞，72 h后熒光顯微鏡和流式細胞術觀察細胞中綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的表達情況，結果顯示，MOI=50時，感染效率為80%以上(圖1A、1B)。qRT-PCR檢測hsa-miR-655在MG63細胞中的相對表達水平，與對照組相比，過表達組hsa-miR-655表達水平顯著升高，差異有統計學意義(P=0.0004，圖1C)，提示成功建立hsa-miR-655過表達的MG63細胞株。

圖1 hsa-miR-655過表達后MG63細胞miR-655水平的檢測。A：熒光顯微鏡觀察GFP陽性MG63細胞；B：流式細胞術檢測細胞GFP陽性率；C：qRT-PCR 檢測hsa-miR-655表達水平Fig.1 Expression of hsa-miR-655 in MG63 cells. A: GFP positive MG63 cells were observed with fluorescence microscopy; B: GFP positive rate was detected with flow cytometry; C: qRT-PCR was used to detect hsa-miR-655 expression level.

2.2 hsa-miR-655抑制CLCF1基因的表達

為探討hsa-miR-655對CLCF1基因的調控作用，筆者分別在mRNA水平和蛋白水平檢測CLCF1基因的表達變化。發現與對照組相比，hsa-miR-655過表達組CLCF1蛋白水平明顯下調(P=0.0053，圖2)，而mRNA水平未見明顯變化(P=0.0986，圖2)。說明hsa-miR-655在轉錄后水平抑制CLCF1基因的表達。

2.3 過表達hsa-miR-655抑制MG63細胞增殖

與對照組相比，過表達組MG63細胞增殖能力明顯降低，差異具有統計學意義(0 h：P=0.203；24 h：P<0.0001；48 h：P<0.0001；72 h：P<0.0001；96 h：P=0.0005)。說明hsa-miR-655在MG63中有抑制增殖作用，見表2。

表2 CCK8實驗檢測hsa-miR-655過表達對MG63細胞的增殖調控作用Table 2 Inhibitory effect of hsa-miR-655 on MG63 cell growth detected with CCK8 assay

注：***表示與對照組比較，差別有統計學意義(P<0.001)。

2.4 hsa-miR-655抑制MG63細胞周期的進展

流式細胞術檢測周期分布，結果提示，hsa-miR-655過表達組較對照組MG63細胞 G0/G1期細胞比例增加(P=0.0048)，S期細胞比例減少(P=0.0133)，差異具有統計學意義(圖3)，由此可見，hsa-miR-655可以使細胞阻滯在G1期，延緩細胞周期進程。

2.5 hsa-miR-655對OPG和RANKL表達的影響

qRT-PCR檢測hsa-miR-655過表達后OPG、RANKL mRNA的變化發現，與對照組比較，過表達組OPG(P=0.0384)、RANKL(P=0.0007)mRNA均有所上調，差異具有統計學意義(圖4A)；Western blot檢測蛋白水平，經圖像分析軟件計算RANKL和OPG相對灰度比值，結果顯示，與對照組比較，過表達組OPG、RANKL蛋白均上調，而OPG/RANKL比值卻降低，差異具有統計學意義(圖4B，表3)。

3 討論

miRNA在骨質疏松的發生和進展中發揮了重要的調控功能。課題組前期研究發現hsa-miR-655能靶向調控絕經后骨質疏松癥關聯基因CLCF1的表達，但hsa-miR-655介導CLCF1基因參與POP的具體機制尚不明確。人成骨肉瘤MG63細胞株具有人成骨細胞表型特征，是最常用的成骨細胞模型之一[6]。本實驗在MG63細胞系中過表達hsa-miR-655，觀察hsa-miR-655對MG63細胞增殖、細胞周期及CLCF1、OPG和RANKL基因表達的影響。結果顯示，過表達 hsa-miR-655顯著抑制MG63細胞的增殖，使MG63細胞G1期阻滯，S期比例減少，從而延緩細胞周期進程。同時，過表達miR-655后，CLCF1蛋白水平明顯下調，而OPG和RANKL表達水平雖然上調，但OPG/RANKL比值卻降低。說明miR-655能通過負調控CLCF1基因的表達，抑制成骨樣細胞MG63的增殖，并下調OPG/RANKL的比值。

圖2 hsa-miR-655抑制CLCF1基因的表達Fig.2 Up-regulation of hsa-miR-655 inhibited CLCF1 expression

組別OPG(相對灰度值) RANKL(相對灰度值)OPG/RANKL比值NC組121.21±1.52139.92±1.501.63±0.23OE組139.52±4.21**173.45±3.95***0.89±0.12**

注：**表示與對照組比較差異有統計學意義(P<0.001)；***表示與對照組比較差異有統計學意義(P<0.0001)，OPG(P=0.0021)，RANKL(P=0.0002)，OPG/RANKL(P=0.0078)。

圖3 FCM測定hsa-miR-655過表達后MG63細胞周期的變化Fig.3 Changes of cell cycle after up-regulation of hsa-miR-655 detected with FCM

圖4 hsa-miR-655過表達對OPG、RANKL表達的影響Fig.4 Up-regulation of hsa-miR-655 increased OPG and RANKL expression

作為一類內源性非編碼小RNA分子，miRNAs通過對靶基因轉錄后水平的調控，在骨代謝中具有重要的調控作用。文獻報道，miR-26 a在骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC)成骨分化過程中表達上調，并通過調控 Wnt信號通路促進 BMSCs的成骨分化[7]。Gao等[8]發現miR-210在人間充質干細胞成骨分化過程表達下調，通過對miR-210的抑制可促進人間充質干細胞成骨分化進程。此外，通過對miRNA表達譜的觀察，發現 miR-21在破骨細胞的分化過程中呈高表達，而其高表達可觸發級聯反應起到促破骨細胞分化的作用，因此miR-21可被認為是早期破骨細胞分化的關鍵調節miRNA[9]。本研究中的hsa-miR-655基因定位于人14q32.31染色體上，自2005年hsa-miR-655首次被發現以來，越來越多的研究對hsa-miR-655基因及其在各種生物學功能中發揮的作用進行了報道。miR-655在癌癥的發生、發展和轉移中起重要作用[10-11]。肝癌中miR-655表達較高的患者生存期短于miR-655表達低的。多變量分析顯示，miR-655是肝癌的獨立危險因素[12]。Kitamura等[13]報道miR-134/487b/655簇能促進TGF-β1誘導的上皮間質轉化現象，并通過直接靶向MAGI2來影響肺癌細胞的耐藥性。筆者前期研究發現，hsa-miR-655 可以靶向結合CLCF1 mRNA的3'UTR區，在轉錄后水平調控CLCF1基因表達。本研究結果進一步證實了miR-655能抑制CLCF1的表達，并對人成骨樣細胞MG63的增殖起調控作用。

CLCF1是B淋巴細胞的催化劑，可通過gp130受體刺激B細胞活化，參與體液免疫。CLCF1屬白細胞介素6(IL-6)細胞因子家族成員，IL-6是骨吸收的主要調節者，其主要通過激活 JAK2/STAT3 信號通路發揮作用[14]。研究表明IL-6 與成骨細胞、基質細胞、破骨細胞及其前體產生密切相關，能促進骨及骨髓中破骨細胞增加。文獻報道[15]JAK2/STAT3是破骨細胞前體細胞分化成熟過程中的關鍵信號通路，三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)競爭性JAK2激酶抑制劑AG490通過下調STAT3(Ser727)磷酸化水平，抑制核因子kB受體活化因子配體誘導的RAW264.7細胞向破骨細胞的分化。課題組前期研究發現，CLCF1在絕經后骨質疏松癥中表達下調，且CLCF1基因過表達后可以激活JAK2/STAT3信號通路[16]。結合本實驗結果，hsa-miR-655通過靶向調控CLCF1基因的表達，下調OPG/RANKL的比值。因此，筆者推測hsa-miR-655對OPG/RANKL的影響可能與JAK2/STAT3信號通路有關。

“骨免疫學”理論認為，骨骼系統與免疫系統之間存在密切關系，免疫失調可導致骨代謝異常。OPG/RANKL/RANK系統則是骨代謝與免疫系統之間的橋梁，OPG、RANKL和其唯一受體RANK形成了一個調節破骨細胞的信號系統，并且是影響破骨細胞分化、發育和功能的最終途徑，在骨質疏松中起重要作用[17]。成骨細胞分泌RANKL，RANKL可激活破骨細胞和破骨細胞前體細胞膜表面RANK受體，引起破骨細胞的形成和活化。OPG/RANKL比例的變化對于維持成骨細胞與破骨細胞之間的平衡很重要[18]。研究表明，IL-6 可以通過各種因素對成骨細胞和破骨細胞之間的OPG/RANKL/RANK 信號通路產生影響[19-20]。IL-6 通過誘導成骨細胞上RANKL 表達，與前破骨細胞上所表達的 RANK 相互作用，經 RANK 信號通路促進破骨細胞分化。研究發現，hsa-miR-655過表達后，OPG和RANKL表達均上調，但OPG/RANKL的比值卻下調。推測hsa-miR-655可能通過CLCF1調控成骨細胞OPG/RANKL系統，進而影響成骨細胞與破骨細胞之間的平衡。而OPG水平的增加可能是由于 RANKL和OPG都在成骨細胞中分泌，RANKL水平增加，OPG的水平進而代償性地提高所導致。

綜上所述，hsa-miR-655可以通過負調控CLCF1基因，抑制成骨樣細胞MG63的增殖和細胞周期進展，促進RANKL、OPG表達并下調OPG/RANKL的比值。但對hsa-miR-655促進RANKL、OPG表達增加的分子機制仍待后續進一步研究。