補腎中藥通過調控Notch1蛋白的表達治療大鼠骨質疏松性骨折的作用研究

李永賢 張順聰 梁德 郭丹青 莫國業 李大星 郭惠智 馮蓬勃 李永巍莫凌 楊志東 唐永超

1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東 廣州 510405 2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510407 3.廣州中醫藥大學中醫骨傷科學國家重點學科實驗室，廣東 廣州 510405

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)影響全世界大多數女性人口，已被WHO列為十大最嚴重疾病之一[1]。骨質疏松性骨折是骨質疏松癥最常見的并發癥之一[2]，增加老年患者的致殘率和死亡風險[1]，并且為經濟帶來極大負擔[3]。因此，深入研究骨質疏松性骨折骨重建的發生機制和防治措施，對提高患者的生存質量和降低死亡率具有重要意義。骨質疏松性骨折發生的主要機理在于成骨細胞的骨形成功能和破骨細胞的骨吸收功能間的失平衡，導致骨量減少、結構退化、骨脆性增加，當載荷超過其自身的支持強度時引起骨折[4]。骨折后骨重建的核心是成骨細胞骨吸收和破骨細胞骨生成反應間的相互耦聯的過程，是一動態連續的過程[5]，而成骨細胞的活化引起骨吸收是骨重建的起始階段，對于骨重建具有不可替代的作用。因此，研究關于調控成骨細胞活化或調亡的機制是防治骨質疏松的重要策略。

近年發現，Notch信號通路調控破骨細胞的分化及功能，并對骨細胞存活及骨重建起關鍵作用[6]。但目前關于Notch信號通路調節骨重建的研究較少，骨質疏松性骨折患者的骨重建機制仍不清楚。因此，闡明Notch信號通路與調控成、破骨細胞分化的具體機制，對于防治骨質疏松相關疾病具有重大意義。骨質疏松性椎體骨折屬祖國醫學“骨萎骨折”的范疇，在對其認識和治療上積累了豐富的經驗，現代研究發現補腎活血法可使減少破骨細胞形成，增加成骨細胞生成，來防治骨質疏松相關疾病。最近研究發現Notch信號通路調節對骨細胞活性及骨重建方面起著關鍵作用，但補腎法是否通過影響Notch信號通路相關因子而調節骨重建尚不清楚。因此，本研究一方面進一步探討Notch信號通路調節成骨、破骨細胞的分化及功能的機制；另一方面，深入研究補腎中藥治療骨質疏松性骨折的作用機理，為以后臨床治療骨質疏松性骨折提供理論基礎和治療靶點。

1 材料和方法

1.1 補腎中藥配制

補腎中藥選取右歸丸加減方，由附子、肉桂、鹿角膠、熟地黃、枸杞子、山茱萸、山藥、菟絲子、杜仲、牛膝、當歸、桃仁、紅花組成，90 ℃煎煮至上清液濃縮為2∶1。冷卻后，濾紙過濾，4 ℃冷藏靜置48 h，離心后取上清液，放入4 ℃冰箱保存備用。灌胃前用蒸餾水配制成10、20、40 mg/mL濃度待用。

1.2 實驗試劑

生理鹽水購于華南醫藥公司，補腎中藥、抗生素購于廣州中醫藥大學第一附屬醫院，其余試劑均購于廣州菲博生物科技公司。

1.3 實驗動物分組與處理

60只SPF級12月齡雌性SD大鼠，(400±20)g，由廣州中醫藥大學動物實驗中心提供，飼養于廣州中醫藥大學SPF級動物實驗中心室內。隨機平均分為5組，分別為正常組、骨質疏松骨折模型組、高、中、低劑量補腎中藥治療組，各組均摘除卵巢，術后3個月形成骨質疏松模型。隨后除正常組外，其余各組在無菌條件下用10%的水合氯醛腹腔麻醉后，取仰臥位，四肢用橡皮筋固定，去毛后酒精消毒右后肢，鋪巾。做左側膝關節內側切口，切開皮膚，皮下組織及肌肉，顯露股骨及髕韌帶，沿髕韌帶內側打開關節腔，用1.0 mm的克氏針于股骨平臺偏前方沿股骨長軸旋入約14～17 mm長度，然后以文氏鉗繼續將克氏針頂入，確保克氏針牢固固定于遠端髓內松質骨中。牽拉推移皮膚使股骨中段暴露切口內，用小型電鉆鋸斷股骨，用生理鹽水沖洗創面后，以4-0號絲線縫合切開的肌肉、關節囊、皮下組織及皮膚，建立起股骨骨折模型。骨松骨折模型成立后，對每只大鼠腹腔注射80萬 U/kg青霉素鈉鹽進行抗感染治療，通過雙能X射線觀察骨折情況(圖1)，每日給予正常組與模型組生理鹽水進行灌胃，治療組分別給予高、中、低劑量補腎中藥灌胃12 w進行治療。

圖1 大鼠股骨骨松骨折模型X光片Fig.1 X-ray photo of osteoporotic fractured femur in the rat

圖2 補腎中藥對血清中堿性磷酸酶、TRAP和骨鈣素含量的影響。A：堿性磷酸酶；B：TRAP破骨標志物；C：骨鈣素注：NC：正常組；MC：骨質疏松骨折模型組；BS-L/M/H：補腎中藥低、中、高劑量治療組。Fig.2 Influence of compound Chinese kidney-tonifying herbal medicine in serum alkaline phosphatase (AKP), strACP (TRAP), and osteocalcin (OC). A: AKP; B: TRAP; C: OC.Note: NC, normal control group; MC, osteoporotic fracture model group; BS-L/M/H, low/middle/high dose of compound Chinese kidney-tonifying herbal medicine-treated group.

1.4 指標檢測

末次實驗結束后對大鼠腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，應用雙能X射線檢測大鼠股骨的骨密度。使用普通采血管和采血針，通過腹主動脈采取血液，靜置1～2 h后在4 ℃下冷凍離心，3 000 r/min，離心10 min，分離上清液得到血清樣品，通過ELISA法測量堿性磷酸酶、骨鈣素、血清抗酒石酸性磷酸酶(serumtar trate-resistantacid phosphatase，strACP)破骨標志等指標含量，對股骨樣品進行甲醛浸泡24 h、脫鈣3～4 w后制作HE染色切片進行病理學檢查以及Western blot法檢測Notch1蛋白的表達情況。

1.5 統計學方法

2 實驗結果

2.1 補腎中藥對血清中堿性磷酸酶、TRAP和骨鈣素含量的影響

ELISA法測定大鼠血清中堿性磷酸酶、TRAP和骨鈣素含量的結果如圖2所示。結果顯示，骨質疏松骨折模型組與正常組相比，堿性磷酸酶與TRAP的含量顯著升高，骨鈣素含量明顯下降，差異均具有統計學意義(P<0.01)。而經過補腎中藥治療后，治療組中的堿性磷酸酶與TRAP的含量顯著降低，骨鈣素含量明顯提升，上述指標在高劑量治療組中與模型組相比差異均具有統計學意義(P<0.01)，呈明顯的劑量依賴性。

2.2 補腎中藥對骨組織中Notch1蛋白表達的影響

Western blot實驗的免疫印跡條帶和光密度值如圖3所示。結果顯示，Notch1蛋白的表達在模型組中受到顯著抑制(與正常組相比，P<0.01)，而補腎中藥具有調節Notch1蛋白表達的作用，且成明顯劑量相關性，3個劑量治療組的Notch1蛋白表達與模型組相比顯著升高(P<0.01)，且高劑量治療組的表達水平與正常組接近。上述結果提示補腎中藥具有調節Notch1蛋白表達的作用。

圖3 補腎中藥對骨組織中Notch1蛋白表達的影響。A：免疫印跡條帶；B：光密度值注：NC：正常組；MC：骨松骨折模型組；BS-L/M/H：補腎中藥低、中、高劑量治療組。Fig.3 Influence of compound Chinese kidney-tonifying herbal medicines in Notch1 protein in bone. A: Lanes of Notch1 protein; B: Quantitative results of different groupsNote: NC, normal control group; MC, osteoporotic fracture model group; BS-L/M/H, low/middle/high dose of compound Chinese kidney-tonifying herbal medicine-treated group.

圖4 各組大鼠股骨骨折端病理學染色切片(200×)Fig.4 Histological examination on rat fractured femurs with H&E staining in different groups (200×)

2.3 補腎中藥對骨密度的影響

病理組織學切片結果如圖4所示，骨質疏松骨折模型組與正常組相比，在骨折端的成骨細胞數量較少，破骨細胞數量較多，而高劑量補腎中藥治療組在骨折端的成骨細胞數量較多，破骨細胞數量較少。X光片骨密度值測量結果顯示(圖5)，模型組的骨密度與正常組相比顯著下降(P<0.01)，經補腎中藥治療后，骨密度顯著回升，高劑量治療組的骨密度與模型組相比差異具有統計學意義(P<0.01)。上述結果提示，補腎中藥具有提高骨密度的效果。

3 討論

骨質疏松性骨折發生的主要機理在于成骨細胞的骨形成功能和破骨細胞的骨吸收功能間的失衡，導致骨量減少、結構退化、骨脆性增加，當載荷超過其自身的支持強度時引起骨折。骨質疏松性骨折的根本原因在于骨質疏松，因此積極地治療骨質疏松是防治OVCF骨質疏松性骨折的前提條件，古人對骨質疏松癥的根本病機認識主要為腎精不足所致?！秲冉洝吩弧皻鈧?，形傷腫”，宋《圣濟總錄》也指出“筋、肉、骨、節誤致所折，則氣血癖滯疼痛”，認為骨折損傷氣血，致血脈離經去行，惡血留滯，形成血瘀，以致氣血運行失常、癖積不散為腫為痛。清·陳士鐸在《辨證錄》中也指出“血不活則癖不能去，癖不去則骨不能接”?；谶@些觀點，認為骨質疏松性骨折的基本病機為腎虛所致，采用補腎法治療取得了較好的療效[7-8]，為防治骨質疏松性骨折提供了新的思路和方法，是當前研究的熱點。

圖5 各組大鼠股骨骨密度值注：NC：正常組；MC：骨松骨折模型組；BS-L/M/H：補腎中藥低、中、高劑量治療組。Fig.5 BMD of the rat femur in different groupsNote: NC, normal control group; MC, osteoporotic fracture model group; BS-L/M/H, low/middle/high dose of compound Chinese kidney-tonifying herbal medicine-treated group.

Notch信號通路為一廣泛應用且高度保守的信號轉導途徑，是影響細胞命運決定的重要通路之一，相鄰細胞之間通過Notch受體或配體傳導信號，調節包括干細胞在內的多種細胞的分化、增殖和調亡[9]。最近研究表明，Notch信號通路參與OPG/RANKL/RANK系統調控破骨細胞的分化及功能，并對骨細胞存活及骨重建起關鍵作用[6]。

Notch信號轉導通路由Notch受體、Notch配體和CSL DNA結合蛋白3部分組成。哺乳動物有4種Notch受體(Notch1、 Notch2、 Notch3、 Notch4)和5種Notch配體(Jagged1、Jagged2、 Delta1、 Delta3、Delta4)，廣泛分布于造血干細胞、胚胎干細胞、淋巴細胞、血管內皮細胞等多種細胞表面，Notch信號由兩個鄰近細胞的Notch受體與配體相互作用而激活Notch。配體與受體結合后，在ADAMI0/KUZ或ADAM17/TACE作用下，Notch受體于細胞膜外被酶切，釋放出和Notch配體連接的胞外部分，隨后在γ-分泌酶的作用下，胞內段被酶切，形成可溶性的NICD(notch intracellular domain)轉移至核內，通過激活轉錄因子SCL而調節基因表達[9]，Notch的下游靶基因主要以HES家族成員為主，包括HESl、HES5、 HEY1等。

目前關于Notch信號通路調節破骨細胞分化及功能影響骨重建相關研究較少。Yamada等[6]發現Notch1轉染的間充質細胞表現出RANKL及OPG基因的表達增加，而巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)表達的強烈抑制，導致破骨細胞分化能力減弱。這些發現表明Notch信號通路同時影響破骨前體細胞和間充質細胞，并對破骨細胞生成產生負向調節作用[10]。有學者發現，人體外敲除骨基質巨噬細胞中的Notch1、Notch2、Notch3，可以促進破骨細胞前體的增殖與分化[11]；破骨細胞中的Notch1失活會抑制其OPG的表達，進而促進破骨細胞的分化與骨吸收能力，從而證明Notch信號轉導通路對破骨細胞具有抑制作用[12]。Duan等[13]指出NF-kB的活性在RANKL誘導的破骨細胞分化和骨吸收中增加。RAW264.7細胞中的HES1的mRNA和蛋白表達在RANKL刺激后增加。因此認為，在RANKL誘導的破骨細胞分化和骨吸收介導的NF-kB信號通路中，Notch信號被激活。在成骨細胞對破骨細胞調節作用方面，Notch信號轉導通路通過促進成骨細胞OPG的表達，從而減弱RANK通路介導的破骨細胞分化作用。Bai等[12]研究還表明破骨細胞上表達有Notch配體(Delta1、 Jagged1和Jagged2)，將成骨細胞上的Notch1敲除后，由于OPG表達的降低可引起破骨細胞數量的增加。而Notch 信號轉導通路調節失調可以導致骨發育失調等疾病[10，13]。近年來通過Notch信號轉導通路調節OPG/RANKL/RANK系統對骨重建的研究主要局限于動物研究，少于與骨質疏松患者相連，骨質疏松性椎體骨折患者骨重建的機制仍不清楚[14]。因此，闡明Notch信號通路與OPG/RANKL/RANK系統相互作用調控破骨細胞分化影響骨重建的具體機制，尋找靶向調控OPG、RANKL表達的Notch信號通路相關配體或受體，對于防治骨質疏松相關疾病具有重大意義。

本研究發現，骨質疏松骨折模型組與正常組相比，在骨折端的成骨細胞數量較少，破骨細胞數量較多。運用補腎中藥治療骨質疏松骨折大鼠后，高劑量治療組在骨折端的成骨細胞數量較多，破骨細胞數量較少，提示補腎中藥具有促進骨性愈合的效果。另外，模型組的骨密度與正常組相比顯著下降(P<0.01)，經補腎中藥治療后，骨密度顯著回升，高劑量治療組的骨密度與模型組相比差異具有統計學意義(P<0.01)。研究發現，骨質疏松骨折模型組與正常組相比，堿性磷酸酶與TRAP的含量顯著升高，骨鈣素含量明顯下降，差異均具有統計學意義(P<0.01)。而經過補腎中藥治療后，治療組中的堿性磷酸酶與TRAP的含量顯著降低，骨鈣素含量明顯提升，上述指標在高劑量治療組中與模型組相比差異均具有統計學意義(P<0.01)，呈明顯的劑量依賴性。另外，Western blot結果也顯示，Notch1蛋白的表達在模型組中受到顯著抑制(與正常組相比，P<0.01)，而補腎中藥具有調節Notch1蛋白表達的作用，且成明顯劑量相關性，3個劑量治療組的Notch1蛋白表達與模型組相比顯著升高(P<0.01)，且高劑量治療組的表達水平與正常組接近。本研究結果提示，補腎中藥能夠通過調節Notch1蛋白的表達來抑制血清中破骨標志物堿性磷酸酶和TRAP的水平，并提高骨鈣素的含量來刺激成骨細胞生成、抑制破骨細胞分化，從而加速骨折的愈合，提高骨密度，對大鼠股骨骨質疏松骨折具有良好的治療作用。