雌激素缺乏上調TNF-α促發(fā)卵巢切除大鼠骨細胞程序性壞死

崔紅旺 孟志斌 王挺銳 祝開忠 史方富 唐崧杰 朱永俊

1.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院脊柱骨病外科，海南 海口 570102 2.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腎病風濕科，海南 海口 570102

骨細胞的死亡在絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)發(fā)病過程中起重要的作用[1]。以往對絕經后骨質疏松癥發(fā)病機制的研究主要集中在雌激素調控細胞凋亡的機制上[2]。筆者前期研究發(fā)現，在卵巢切除(ovariectomized，OVX)大鼠骨質疏松發(fā)病過程中，程序性壞死是引起骨細胞死亡的另一種重要方式[3]。然而，雌激素缺乏是如何促發(fā)骨細胞程序性壞死的發(fā)生機制，目前尚未有文獻報道。

腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)對PMOP骨代謝的調節(jié)起著重要作用[4]。研究已證實，絕經前健康婦女接受OVX術后8 w TNF-α明顯增加，這與骨吸收指標密切相關[5]。TNF-α與其受體(tumor necrosis factor receptors，TNFR)作用可激活細胞程序性死亡信號轉導途徑進而導致細胞發(fā)生程序性壞死(necroptosis)[6]。在OVX大鼠骨量丟失過程中，骨細胞程序性壞死是否與TNF-α相關及其機制尚不清楚。本研究以OVX大鼠骨質疏松模型為研究對象，探討雌激素缺乏骨細胞發(fā)生程序性壞死的機制，從而進一步完善絕經后骨質疏松癥的發(fā)病機制，為防治絕經后骨質疏松癥尋找出一條新的途徑。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

成年健康雌性12 w齡的Sprague-Dawley大鼠，體重220～260 g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供。動物許可證號：SCXK(渝)2012-0001。飼養(yǎng)場所由海南省藥物安全性評價研究中心提供：標準層流SPF級動物房。飼養(yǎng)條件：5只/籠，12 h晝夜節(jié)律光照，室溫20～24 ℃，相對濕度(55±5)%。所有動物自由活動，給予標準飲食，自由飲水。實驗過程中嚴格執(zhí)行海南醫(yī)學院生物醫(yī)學研究倫理委員會批準的動物保護法案。

1.2 主要試劑

E2(17β-estradiol，美國Sigma-Aldrich公司)；necrostatin-1(美國Sigma-Aldrich)；Z-VAD-fmk (美國MP Biomedicals公司)；小鼠anti-RIP1單克隆抗體、兔RIP3多克隆抗體(美國 abcam)；MLKL(美國 Santa Cruz)；Drp1(美國 Cell Signaling Technology)，兔抗β-actin單克隆抗體；骨組織抗原修復液(上海舜百生物科技有限公司)；Access Estradiol試劑盒(美國 Beckman Coulter)；Envision免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；EDTA(德國巴斯夫)。

1.3 實驗方法

1.3.1實驗分組：實驗分為5組，60只Sprague-Dawley大鼠被隨機分為Control組(假手術，12只)和OVX組(卵巢切除術，48只)兩組。OVX組行雙側卵巢切除術，Control組行假手術。OVX組實驗大鼠再為4組：OVX+vehicle組、OVX+Nec-1組、OVX+Z-VAD組、OVX+E2組，每組12只。

1.3.2實驗模型的建立及藥物干預方法：大鼠適應性飼養(yǎng)7 d后，分別行雙側卵巢切除術或假手術[7]。從術后4 w開始，所有實驗大鼠均通過腹腔注射給藥，每日一次，連續(xù)給藥4 w。OVX+vehicle組大鼠按1 000 μL/(kg·d)給予腹腔注射10% DMSO液；OVX+Nec-1組大鼠按1.65 mg/(kg·d)[8]給予腹腔注射Nec-1；OVX+Z-VAD組按1.0 mg/(kg·d)[9]腹腔注射Z-VAD；OVX+E2組按10μg/(kg·d)[8]腹腔注射E2[10]。Control組按1 000 μL/(kg·d)給予腹腔注射10%的DMSO液。

1.3.3標本的收集與處理：因筆者前期實驗已證實大鼠骨細胞發(fā)生程序性壞死的高峰在OVX術后8 w[3]，故本實驗選取術后8 w處死各組大鼠。銳性剔除脛骨近端骨表面的軟組織，髓腔用0.9%的生理鹽水灌洗。左側標本立即投入液氮保存，用于Western blot檢測蛋白表達；右側每組6例標本用電鋸切割脛骨近端，固定于2.5%的戊二醛磷酸鹽緩沖液中用于透射電鏡掃描。剩余右側6例標本固定于4%的多聚甲醛，用于Micro-CT掃描分析骨組織微結構變化，掃描完成后標本應用15%的EDTA脫鈣液脫鈣4 w，制作石蠟標本用于免疫組化檢測。

1.3.4血清E2的測定：所有實驗大鼠在行OVX手術或sham手術時和實驗結束時行尾靜脈穿刺采血，普通生化采血管收集靜脈血，室溫靜置血清樣本完全凝聚，3000 rpm離心10 min，吸取上清500 μL，于海南醫(yī)學院學第一附屬醫(yī)院檢驗科使用Access Estradiol試劑盒在UniCel Dxi 800 Access儀進行E2的檢測。

1.3.5Micro-CT掃描骨組織微結構形態(tài)：收集標本固定在4%的多聚甲醛，24 h內掃描骨組織微結構。將股骨近端放入CT掃描儀(SCANCO Medical AG 瑞士)的專用杯罩中，設置掃描參數：15 μm分辨率，70 kVp，114 μA和 250 ms 掃描速度[11]。掃描完成后保存數據，3D重建骨組織微結構，輸出參數有骨密度(bone mineral density，BMD)、骨體積分數(bone volume fraction，BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁數目(trabecular number，Tb.N)、骨小梁間距(trabecular separation，Tb.Sp)，分析閾值為245[12]。

1.3.6投射電鏡觀察骨細胞形態(tài)變化：電鏡標本脫鈣后，將骨組織修剪為1 mm3大小的組織塊，送檢于重慶醫(yī)科大學電鏡室制作電鏡標本。2%的鋨酸(PH為7.4)常溫下固定4 h；在4 ℃下，經50%、70%、80%、90%的乙醇梯度脫水(各20 min)，轉入90%丙酮20 min，再轉入常溫下100%的丙酮(20 min×3次)。然后包埋于環(huán)氧樹脂包埋劑中，放置在60 ℃恒溫箱中加熱48 h，聚合硬化后形成包埋塊。應用超微切片機將標本切成50 nm超薄切片，放置在涂有formvar-coated的銅網格上晾干。最后用3%的醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，于透射電鏡下觀察骨細胞超微結構。

1.3.7免疫組化染色檢測TNF-α、RIP1、RIP3在骨組織中的表達：采用Envision免疫組化染色法檢測TNF-α、RIP1、RIP3在骨細胞的表達情況。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，骨組織抗原修復液100 μL覆蓋組織，放置于37 ℃恒溫箱中孵育30 min，山羊血清封閉液100 μL，室溫孵育10 min；在組織上滴入50 μL左右的一抗，在4 ℃冰箱中孵育過夜(一抗稀釋比例為TNF-α 1∶100，RIP1 1∶200，RIP3 1∶100)，按試劑盒說明書依次滴加試劑1Polymer Helper和試劑2 poly-HRP anti-Rabbit IgG 或 poly-HRP anti-Mouse IgG，DAB顯色。在光學顯微鏡下以細胞漿中出現棕黃色為TNF-α或RIP1或RIP3陽性。采用Leica DM6000 B全自動數碼成像及分析系統檢測TNF-α、RIP1和RIP3蛋白表達情況，每個樣本隨機選6個視野計算陽性細胞百分數，進行統計分析。

1.3.8Western blot檢測MLKL、Drp1蛋白的表達：從液氮中取出骨組織標本約200 mg投入研缽，加入液氮充分研磨成粉末狀，加入 RIPA裂解液/PMSF混合液，使蛋白充分裂解，提取骨組織總蛋白。測定蛋白濃度，并配平；凝膠電泳分離蛋白質，轉膜，5%BSA-TBST室溫封閉；加一抗：RIP1、 RIP3、TNF-α、MLKL、Drp1 (稀釋比例均為1∶000)，β-actin(1∶2000)， 4 ℃過夜；加入二抗37 ℃孵育1 h；TBST洗膜，ECL發(fā)光顯色。以β-actin作為內參，采用vilber fusion fx7分析軟件進行定量分析。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 OVX大鼠雌激素缺乏致大鼠股骨近端骨量丟失

E2的檢測結果如圖1。在OVX+vehicle組、OVX+Nec-1組、OVX+Z-VAD組，OVX術后8 w E2較術前明顯降低 (P<0.01)，而在Control和OVX+E2組術后8 w的 E2與術前比較差異無統計學意義。OVX+E2組術后8 w大鼠E2水平較OVX+vehicle組明顯升高 (P<0.01)。

圖1 各組血清E2變化注：與術前比較，##P<0.01；與術后OVX + vehicle組比較，**P<0.01。Fig.1 Changes of serum E2 in each groupNote: ##P<0.01 vs preoperative in each group; **P<0.01 vs the OVX + vehicle group after OVX.

Micro-CT掃描脛骨近端，3D重建骨組織微結構分析BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp和骨密度，結果見圖2、3。與Control組比較，OVX+vehicle組BV/TV、Tb.Th、Tb.N明顯降低(P<0.01)，而Tb.Sp顯著增大(P<0.01)，脛骨近端骨組織呈明顯退變狀態(tài)。與OVX+vehicle組比較，應用Nec-1或Z-VAD或E2治療OVX大鼠均能有效減輕骨組織的微結構退變。與Control組比較，OVX+vehicle組BMD明顯降低(P<0.01)；OVX+Nec-1組和OVX+E2組的BMD比OVX+vehicle組增高(P<0.05)，而OVX+Z-VAD組與OVX+vehicle組的BMD相比差異無統計學意義。

圖2 雌激素缺乏對去卵巢大鼠脛骨近端微結構的影響注：與對照組比較，##P<0.01；與OVX+vehicle組比較，**P<0.01Fig.2 The effect of estrogen deficiency on bone microstructure in the proximal tibia of OVX ratsNote: ## P<0.01 vs the control group; **P<0.01 vs the OVX + vehicle group.

2.2 雌激素缺乏通過上調TNF-α促發(fā)骨細胞發(fā)生程序性壞死

免疫組化檢測程序性壞死的關鍵信號分子RIP1和RIP3及TNF-α蛋白在脛骨近端骨細胞表達情況見圖4，結果顯示RIP1、RIP3及TNF-α蛋白在骨細胞均有表達，主要表達在骨細胞的胞漿。計算各個蛋白陽性細胞的百分率進行統計學分析顯示，與Control組比較，OVX+vehicle組RIP1、RIP3及TNF-α陽性細胞的百分率顯著增高(P<0.01)；Nec-1治療后明顯降低RIP1和RIP3陽性細胞的百分率(P<0.01)，而對 TNF-α蛋白表達無影響； Z-VAD治療后對 RIP3和RIP1蛋白表達無影響；OVX+E2組的TNF-α、RIP1、RIP3陽性細胞的百分率(P<0.01)較OVX+vehicle組明顯降低(P<0.01)。

圖3 雌激素缺乏對去卵巢大鼠脛骨近端骨密度的影響注：與對照組比較，##P<0.01；與OVX+vehicle組比較，*P<0.05。Fig.3 The effect of estrogen deficiency on bone mineral density in the proximal tibia of OVX ratsNote: ##P<0.01 vs the control group; *P<0.05 vs the OVX + vehicle group.

圖4 雌激素缺乏對去卵巢大鼠骨細胞TNF-α、RIP1、RIP3 蛋白表達的影響(標尺25 μm)注：與對照組比較，##P<0.01；與OVX+vehicle組比較，**P<0.01。Fig.4 Effect of estrogen deficiency on the expression of TNF-α, RIP-1, and RIP-3 in osteocytes of OVX rats (Scale bar represents 25 μm)Note:## P<0.01 vs the control group; **P<0.01 vs the OVX + vehicle group.

電鏡下觀察骨組織發(fā)現，在OVX+vehicle組可見有骨細胞呈典型壞死形態(tài)特征，細胞器腫脹，細胞膜破裂，胞漿內容物外溢，見圖5。在Control組和OVX+E2組骨細胞的結構正常，OVX+Z-VAD和OVX+Nec-1組僅可見到輕度腫脹和正常的骨細胞。

2.3 雌激素缺乏對程序性壞死下游信號分子MLKL、Drp1表達的影響

Western blot檢測程序性壞死的下游信號分子MLKL和Drp1蛋白表達，結果顯示，與Control組相比，OVX+vehicle組的MLKL和Drp1蛋白表達明顯增高(P<0.01)；Nec-1或E2均能有效抑制MLKL和Drp1蛋白表達(P<0.01)；而Z-VAD對MLKL和Drp1蛋白表達無影響，見圖6。

3 討論

圖5 透射電鏡觀察各組骨細胞形態(tài)學變化(標尺為1 μm)Fig.5 The morphological change of osteocytes visualized with TEM (Scale bar represents 1 μm)

圖6 Western blot分析各組骨細胞MLKL、Drp1蛋白的表達注：與對照組比較，##P<0.01；與OVX+vehicle組比較，**P<0.01Fig.6 The expressions of MLKL and Drp1 were detected using Western blottingNote: ## P<0.01 vs the control group; **P<0.01 vs the OVX + vehicle group.

PMOP是由于雌激素缺乏導致的骨量降低及骨小梁微結構退變的代謝性骨骼病變。骨細胞過度死亡在PMOP的發(fā)病過程中起著重要作用，骨細胞的大量死亡破壞了骨細胞-小管結構體系，影響了骨陷窩-小管系統里液體流動的改變，阻礙了骨組織重建的信息傳遞，結果形成了不可修復的骨缺損[13]。

以往研究認為，骨細胞凋亡是PMOP發(fā)病過程中骨細胞死亡的主要方式[14]，而筆者前期的研究發(fā)現，OVX大鼠PMOP模型中大量骨細胞發(fā)生了程序性壞死[3]。為探討雌激素缺乏導致骨細胞發(fā)生程序性壞死的機制，本研究應用大鼠OVX模型成功模擬了PMOP的發(fā)病過程，并首次探討了OVX大鼠術后TNF-α變化與骨細胞程序性壞死的關系。

程序性壞死是一種caspase非依賴的、可以被調控的細胞程序性死亡方式，它可以被TNF-α、toll樣受體、氧化應激等因素促發(fā)[15-16]。程序性壞死的細胞具有壞死的形態(tài)學特征[17]，且可以被Nec-1特異性抑制，而不受凋亡抑制劑如Z-VAD 的影響[15]。雖然細胞程序性壞死的確切機制還未完全清楚，但是RIP1和RIP3在細胞程序性壞死的發(fā)生過程中起著關鍵作用[18-19]，RIP1去泛素化后招募RIP3磷酸化，促使程序性壞死小體的形成[16]。本實驗OVX+vehicle組中，研究發(fā)現了大量的典型壞死骨細胞，而且RIP1和RIP3陽性細胞百分率明顯高于Control組；應用Nec-1或E2治療OVX大鼠后，RIP1陽性率明顯下降，骨組織中看不到壞死樣的骨細胞，而Z-VAD治療OVX大鼠后骨細胞無此變化，這些結果與程序性壞死的特征一致[15-17]。這說明由于缺乏E2，OVX大鼠骨細胞發(fā)生了程序性壞死。另外，研究還發(fā)現，OVX+vehicle組的TNF-α陽性細胞百分率明顯高于Control組，而應用E2治療后，TNF-α的陽性率明顯下降，這與RIP1的變化趨勢一致。由此可推測，骨細胞程序性壞死可能與骨細胞TNF-α的高表達相關，其機制有待進一步研究證實。

研究已證實RIP1和RIP3能相互磷酸化與MLKL，共同形成程序性壞死小體 “necrosome”，啟動程序性壞死[16]。MLKL能把程序性壞死小體“necrosome”的死亡信號傳遞給線粒體，使線粒體發(fā)生功能障礙導致細胞發(fā)生程序性壞死[20]。線粒體分裂調節(jié)蛋白Drp1已被證實參與調節(jié)大多數的細胞死亡過程，如Bras等[21]研究發(fā)現，慢性淋巴細胞白血病B細胞接受刺激后引起絲氨酸蛋白酶活化，促使Drp1轉位到線粒體，使線粒體分裂，導致細胞發(fā)生程序性死亡。本研究發(fā)現OVX+vehicle組MLKL和 Drp1蛋白水平顯著增高，而應用Nec-1或E2治療OVX大鼠后，MLKL和Drp1蛋白水平下降。這與文獻[20-21]報道一致， MLKL和Drp1可能作為程序性壞死小體“necrosome”的下游信號分子參與了骨細胞程序性壞死的發(fā)生。然而在細胞執(zhí)行程序性壞死過程中，Drp1的作用存在爭議，Moujalled等[22]研究證實，Drp1并非是程序性壞死信號通路的關鍵因素。因此對于程序性壞死下游信號分子通路的確切調節(jié)機制有待于進一步深入研究。

綜上所述，在OVX大鼠PMOP模型中，骨細胞發(fā)生程序性壞死可能是由雌激素缺乏上調TNF-α的表達所促發(fā)，MLKL和Drp1可能是骨細胞發(fā)生程序性壞死的關鍵下游信號分子。