糖尿病合并去勢大鼠骨微結構退化的研究

蔡嚇明 魏建銘

福建莆田學院臨床醫學院，福建 莆田 351100

在我國約有80%的60歲以上的老年人群患有骨質疏松癥(osteoporosis，OP)，女性患病人數是男性的6倍，有40%～50%的50歲以上婦女可能發生絕經后骨質疏松性骨折[1]。除了增齡、缺鈣和女性絕經等已知的OP危險因素外，血糖升高與OP 密切相關[2]。有研究發現糖尿病會讓女性的絕經期提前，并增加了她們罹患骨骼疾病的風險。而骨強度下降是OP 的根本特點[3]，骨強度取決于骨密度(bone mineral density，BMD)和骨質量，BMD測定是世界上公認的骨質疏松癥的診斷金標準，本文通過建立絕經期糖尿病骨質疏松癥大鼠模型，旨在探討糖尿病合并去勢大鼠骨微結構退化、OP發生情況及其影響因素。

1 材料和方法

1.1 模型的建立

選用清潔級3月齡SD雌性大鼠40只，體重200～220 g，由福州吳氏動物中心提供。去勢組切除大鼠雙側卵巢，假手術組手術過程不切除卵巢而切除小塊脂肪組織。STZ(美國SANLAN公司提供)誘發糖尿病。STZ用0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液配成1%(g/mL)濃度，按60 mg/kg左下腹腔內注射。72 h后取尾血用One Touch血糖測定儀測血糖，凡血糖≥167 mmol/L即為糖尿病。糖尿病合并去勢組用去卵巢與鏈脲佐菌素復合造模。隨機分為對照組、假手術組、去勢組、糖尿病組和糖尿病合并去勢組，6 w和15 w后測定。

1.2 骨標志物檢測

10%水合氯醛麻醉后，腹主動脈采血，-80℃冰箱保存。采用羅氏COBASE601全自動電化學發光免疫分析儀檢測骨標志物(β-膠原降解產物)，嚴格按照說明書進行操作。

1.3 骨密度值檢測

采用Lunar iDNA型雙能X線骨密度儀(美國通用)檢測，測量第4腰椎骨密度和股骨近端，由2名經驗豐富的放射科醫生進行共同確診，用自帶的軟件進行數據分析。

1.4 骨組織計量學指標比較

麻醉取股骨，入4%多聚甲醛固定，逐級脫水脫脂后，再以10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣，制成蠟塊，連續切片(厚度4 μm)。蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡(日本Olympus BX51T-PHD-J11)觀察骨細胞與細胞外基質分布。隨機選取，高倍鏡視野下觀察骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁間距(Tb.SP)，同樣要求在不同的視野各測定一次，取平均值。

1.5 Van Gieson氏膠原纖維染色

切片以Van Gieson氏進行膠原纖維染色，光鏡下觀察骨膜膠原纖維沉積情況。

1.6 統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件進行t檢驗，Pearson相關性分析。

2 結果

2.1 骨標志物水平比較

與對照組相比，假手術組沒有出現明顯改變。去勢6 w和15 w組骨β-膠原降解產物水平明顯升高，骨密度值明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。糖尿病15 w松質骨β-膠原降解產物水平明顯升高，骨密度值明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。糖尿病合并去勢組6 w和 15 w組松質骨β-膠原降解產物水平明顯升高，骨密度值明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05)(圖1、2)。

圖1 各組β-膠原降解產物水平比較(P<0.01)Fig.1 Comparison of the levels of beta collagen degradation products among each group(P<0.01)

圖2 各組骨密度值比較(P<0.01)Fig.2 Comparison of bone mineral density among each group (P<0.01)

2.2 各組骨組織形態學比較

圖3 各組股骨骨松質光鏡下的結構特點(HE法，標尺示20 μm)。A：6 w組各組股骨骨松質光鏡下結構特點(A1：對照組，A2：假手術組，A3：去勢組，A4：糖尿病組，A5：糖尿病合并去勢組)；B：15 w組各組股骨骨松質光鏡下結構特點(B1：對照組，B2：假手術組，B3：去勢組，B4：糖尿病組，B5：糖尿病合并去勢組)Fig.3 The structural characteristics of the cancellous bone in femurs under light microscope (HE method, ruler 20 μm). A: in 6 w groups (A1: control group, A2: sham operation group, A3: ovariectomized group, A4: diabetes group, A5: diabetes mellitus and castration group); B: in 15 w groups (B1: control group, B2: the sham operation group, B3: ovariectomized group, B4: diabetes group, B5: diabetes mellitus and castration group).

對照組股骨的骨小梁粗大(圖3A1)。假手術6 w組骨小梁粗大稍厚，未見吸收或斷裂現象(圖3A2)。去勢6 w組骨小梁變細變薄，骨髓腔變大(圖3A3)。糖尿病6 w組骨小梁尚未見大片成塊狀缺失(圖3A4)。糖尿病合并去勢6 w組(圖3A5)。對照組15 w組股骨的骨小梁依然粗大厚實(圖3B1)。假手術15 w組股骨的骨小梁較多較厚，未見骨小梁斷裂(圖3B2)。去勢15 w組骨小梁排列稀疏變薄，不規則彎曲、間距增大，結構紊亂(圖3B3)。糖尿病15 w組骨小梁排列稀疏、出現編織狀纖維骨組織，部分骨小梁斷裂(圖3B4)。糖尿病合并去勢15 w組骨小梁稀疏變薄斷裂。出現編織狀纖維骨組織，骨髓腔普遍增大，腔內造血組織明顯減少(圖3B5)。

2.3 組織計量學指標測定統計學結果

與對照組相比，假手術組沒有出現明顯改變。去勢6 w和15 w組骨小梁間距明顯升高，骨小梁厚度明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。糖尿病15 w骨小梁間距明顯升高，骨小梁厚度明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。糖尿病合并去勢組6 w和15 w組松質骨骨小梁間距明顯升高，骨小梁厚度明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05)(圖4、5)。

圖4 各組骨小梁厚度比較(P<0.01)Fig.4 Comparison of trabecular thickness among each group(P<0.01)

2.4 骨膜膠原代謝的改變

Van Gieson氏染色結果，對照6 w組骨基質膠原纖維積聚有序(圖6A1)。假手術6 w組骨基質膠原纖維積聚、緊密排列，方向有序(圖6A2)。去勢6 w組骨基質膠原纖維染色較深(圖6A3)。糖尿病6 w組骨基質膠原纖維較多，但松散(圖6A4)。糖尿病合并去勢6 w組骨基質膠原纖維染色淺，排列稀疏(圖6A5)。對照15 w組膠原纖維緊密排列(圖6B1)。假手術15 w組骨基質膠原纖維染色深，緊致有序(圖6B2)。去勢15 w組骨基質膠原纖維松散無序分布(圖6B3)。糖尿病15 w組骨基質膠原纖維染色淺，排列稀疏(圖6B4)。糖尿病合并去勢15 w組膠原纖維稀疏，明顯減少(圖6B5)。

圖6 各組股骨骨松質膠原纖維分布特點(Van Gieson法，標尺示20 μm)。A：6 w組各組股骨骨松質膠原纖維分布特點(A1：對照組，A2：假手術組，A3：去勢組，A4：糖尿病組，A5：糖尿病合并去勢組)；B：15 w組各組股骨骨松質膠原纖維分布特點(B1：對照組，B2：假手術組，B3：去勢組，B4：糖尿病組，B5：糖尿病合并去勢組)Fig.6 Femoral bone collagen fiber distribution characteristics of loose matter (Van Gieson method, ruler 20 μm). A: distribution characteristics of collagen fiber in the femoral bone in 6 w (A1: control group, A2: sham operation group, A3: ovariectomized group, A4: diabetes group, A5: diabetes mellitus and castration group); B: distribution characteristics of collagen fiber in the femoral bone in 15 w (B1: control group, B2: sham operation group, B3: ovariectomized group, B4: diabetes group, B5: diabetes mellitus and castration group).

圖5 各組骨小梁間距比較(P<0.01)Fig.5 Comparison of trabecular separation among each group(P<0.01)

2.5 骨膜膠原面密度積分統計學結果

與對照組相比，假手術組沒有出現明顯改變。去勢15 w組、糖尿病15 w組、糖尿病合并去勢組6 w和15 w組膠原面密度積分明顯明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05)(圖7)。

圖7 各組膠原纖維含量比較(P<0.01)Fig.7 Comparison of levels of collagen fibers among each group(P<0.01)

3 討論

本研究采用復合造模法，建立絕經期糖尿病骨質疏松癥大鼠模型[4]。雌激素受體是成骨細胞主要受體，通過與雌激素的結合可以增加成骨細胞的活性，促進新生骨的形成。絕經期后內源性雌激素分泌下降[5]，對成骨細胞的作用減低，會加速人體內骨質的丟失，與OP有著密切聯系[6-7]。在正常骨代謝中，骨骼重建是在破骨細胞和成骨細胞作用下有序進行的。本文研究結果提示，絕經后OP婦女存在明顯的骨代謝異常。Ⅰ型膠原蛋白與骨結合蛋白是骨骼組成的主要成分，而Ⅰ型膠原占骨膠原的97%以上，提供礦化的骨架。β-膠原降解產物是Ⅰ型膠原蛋白的降解產物，通過檢測β-膠原降解產物可了解到患者破骨細胞活性。由于OP患者骨吸收增強，使得β-膠原降解產物釋放更多。從而間接了解骨轉換程度，絕經后OP婦女體內破骨細胞的活性增強，且骨吸收速度遠遠超過了骨形成速度。臨床診斷OP的金標準為骨密度值。雌激素和骨標志物與絕經后婦女OP的關系密切[7]。另一方面，內源性雌激素的減少對下丘腦-垂體的負反饋調節能力下降，垂體分泌的卵泡刺激素大量增加，導致破骨細胞數量和活性增強，骨質流失進一步加快[8]。

另外，高血糖的毒性逐漸造成各種代謝紊亂，引起晚期糖基化終末產物(advanced glycationend products，AGEs)的蓄積，直接影響成骨細胞的增殖，在一定程度上影響了骨膠原蛋白的形成，Ⅰ型膠原合成減少[9]。糖尿病患者由于胰島素分泌相對或絕對不足，抑制了成骨細胞的活性，骨形成降低。絕經后糖尿病患者出現骨代謝的影響因素較多，如雌激素、血清抗酒石酸酸性磷酸酶等[10]。高血糖致滲透性利尿，促使鈣、磷排出增加，血鈣濃度降低，刺激甲狀旁腺激素分泌，溶骨作用增強，骨吸收增加，骨礦化減少而致骨密度下降[11]。長期高血糖狀態導致糖尿病患者體內HbA1c蓄積，直接或間接影響骨蛋白及骨細胞分化，骨形成減少，骨脆性增加[12]。糖尿病導致微血管病變會降低骨血流量，骨脆性增加、骨量流失[13]。高糖環境的毒性作用，特別是對成骨細胞合成能力的抑制并促進骨吸收[14]。

大量動物實驗和臨床觀察發現雌性動物的糖尿病發病率遠不及雄性，而去勢后雌性動物糖尿病發病率升高。雌激素調節胰島素受體的基因表達，雌激素還能通過雌激素受體ERa起到一定的抗P細胞調亡作用，從而保護胰島功能[15]。研究結果證實雌激素與糖代謝并不是兩個獨立的個體，糖尿病的發生發展與更年期女性內源性雌激素水平的變化具有相關性。研究提示絕經和血糖量均與骨質疏松的形成發展密切相關[16]，其中時間、病程及交互有待進一步研究，為臨床預防和治療提供合理的指導。