丹參酮ⅡA對(duì)生長(zhǎng)期大鼠骨密度及骨形態(tài)計(jì)量學(xué)影響的研究

楊芳芳 高玉海 葸慧榮 陳克明 馬慧萍

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000 2.蘭州軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730050 3.蘭州軍區(qū)總醫(yī)院骨科研究所，甘肅 蘭州 730050

隨著老齡化社會(huì)的到來(lái)，骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)的發(fā)生率逐年上升，對(duì)人類生活質(zhì)量和身體健康帶來(lái)了嚴(yán)重的威脅。目前臨床治療OP的化學(xué)合成藥物具有一定療效，但都有較大的不良反應(yīng)[1]。我國(guó)清代王清任所著《醫(yī)林改錯(cuò)》指出，“血液瘀滯，經(jīng)脈不暢，水谷精微得不到布散，不僅臟腑因濡養(yǎng)不足而衰弱，骨髓也因此不得充潤(rùn)……”，提示我們從活血化瘀的角度也有可能防治OP。蔡輝等[2]認(rèn)為活血化瘀中藥在治療骨質(zhì)疏松癥上呈現(xiàn)出多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多通路、效果明顯、毒副作用少等特點(diǎn)。因此探索活血中藥預(yù)防與治療骨質(zhì)疏松癥無(wú)疑具有潛在價(jià)值。丹參酮ⅡA是活血化瘀中藥丹參中的主要有效成分之一，實(shí)驗(yàn)研究表明丹參酮ⅡA能提高體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)增殖速率，對(duì)BMSCs向成骨細(xì)胞分化有明確的誘導(dǎo)作用[3]。本實(shí)驗(yàn)研究了口服丹參酮ⅡA對(duì)生長(zhǎng)期大鼠骨密度和骨質(zhì)量的影響，以初步探討用活血化瘀藥物預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的可行性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

丹參酮ⅡA(陜西寶雞辰光生物科技有限公司，批號(hào)：20150816)；淫羊藿苷(陜西寶雞辰光生物科技有限公司，批號(hào)：20150125)；10%水合氯醛(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；雙能X射線骨密度儀(Lunar Prodigy, GE 公司，美國(guó))；骨形成指標(biāo)降鈣素檢測(cè)試劑盒和骨吸收指標(biāo)TRAP5b檢測(cè)試劑盒(Rat-MIDTM Osteocalcin EIA和Rat TRAPTMELISA，IDS公司，丹麥)；SP1600硬組織切片機(jī)(LEICA公司，德國(guó))；正置熒光顯微鏡(BX51，Olympus，日本)；酶標(biāo)儀(Epoch, BioTek公司，美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

1月齡Wistar雌性大鼠30只，體重(95±3)g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)：SCXK(甘)2011-0001)，大鼠飼養(yǎng)于 SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)室，自由飲水(自來(lái)水)和進(jìn)食。

1.3 研究方法

1.3.1分組和給藥：實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分3組，每組10只，分別為丹參酮ⅡA組、淫羊藿苷組(陽(yáng)性對(duì)照)和正常對(duì)照組。丹參酮ⅡA用蒸餾水配成 1.1 mg/mL的混懸液，按每只大鼠 11 mg/(kg·d)給藥；淫羊藿苷配成2.5 mg/mL的混懸液，按每只大鼠 25 mg/(kg·d)給藥；正常對(duì)照組灌服相同體積蒸餾水。每?jī)芍芊Q一次體重。

1.3.2骨密度的測(cè)定：一個(gè)月測(cè)1次全身骨密度，檢測(cè)前先腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉，待檢測(cè)到用藥組與對(duì)照組間有顯著性差異后即處死所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，剝離椎骨、雙側(cè)股骨和脛骨，并保存于10%多聚甲醛中，測(cè)定椎骨和左側(cè)股骨骨密度。

1.3.3骨形態(tài)計(jì)量分析：將右側(cè)脛骨從10%多聚甲醛中取出。依次進(jìn)行脫水、包埋、切片，再用1200、1500、2000目的砂紙均勻打磨至半透明，用品紅-苦味酸進(jìn)行染色。鏡下觀察骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，用IPP 6.0軟件分析骨小梁相關(guān)參數(shù)，并觀察骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3.4測(cè)定血清生化指標(biāo)：大鼠麻醉后，腹腔動(dòng)脈取血，以5 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取血清置于-80 ℃冰箱保存；按 ELISA試劑盒說(shuō)明書步驟測(cè)定血清中TRACP 5b和骨鈣素(osteocalcin，OC)含量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定405 nm和450 nm處吸光值，計(jì)算含量。

2 結(jié)果

2個(gè)月后，各組實(shí)驗(yàn)大鼠的存活率都是90%。

2.1 大鼠體重變化情況

3組大鼠的體重在實(shí)驗(yàn)期間始終無(wú)明顯差異，丹參酮ⅡA組在第9周的體重略有下降，但與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。說(shuō)明丹參酮ⅡA灌胃對(duì)大鼠體重?zé)o明顯影響。

圖1 大鼠體重測(cè)定結(jié)果Fig.1 The results of body weight in rats

2.2 大鼠骨密度測(cè)定結(jié)果

3組大鼠在第1個(gè)月的全身骨密度檢查結(jié)果雖有差異，但并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。第2個(gè)月的檢查結(jié)果見圖2，可以看到，與對(duì)照組相比，丹參酮ⅡA組和淫羊藿苷組的全身骨密度顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而丹參酮ⅡA和淫羊藿苷組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。大鼠處死后的離體骨密度檢測(cè)結(jié)果見圖3，可見丹參酮ⅡA組離體股骨骨密度極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，離體椎骨骨密度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；丹參酮ⅡA組和淫羊藿苷組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明丹參酮ⅡA能有效提高大鼠全身和離體骨密度。

圖4 大鼠脛骨近心干骺端骨組織形態(tài)學(xué)變化(40×，標(biāo)尺=1 000 μm)。A：對(duì)照組；B：淫羊藿苷組；C：丹參酮ⅡA組Fig.4 Morphology of the proximal metaphysis of the tibia (40×, ruler=1 000 μm). A: Control group; B: Icariin group; C: Tanshinone II A group.

圖2 大鼠全身骨密度值測(cè)定結(jié)果注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。Fig.2 The results of the whole-body bone mineral density in ratsNote: Compared with the control group, *P<0.05，**P<0.01.

圖3 大鼠離體骨密度測(cè)定結(jié)果注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。Fig.3 The results of bone mineral density ex vivoNote: Compared with the control group, *P<0.05，**P<0.01.

2.3 骨形態(tài)計(jì)量學(xué)分析結(jié)果

由圖4可知，丹參酮ⅡA組和淫羊藿苷組脛骨骨組織的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較對(duì)照組致密，量化分析結(jié)果顯示(表1)，丹參酮ⅡA組和淫羊藿苷組的骨小梁數(shù)目、骨小梁寬度和骨小梁面積百分比顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而骨小梁分離度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。說(shuō)明可以改善松質(zhì)骨的微結(jié)構(gòu)，提高骨質(zhì)量，見表1。

2.4 血清骨代謝指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組相比，給藥組均能顯著提高大鼠血清中OC的含量(P<0.05)，同時(shí)顯著降低血清中TRACP 5b的含量(P<0.05)。說(shuō)明丹參酮ⅡA促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收的雙重活性來(lái)提高骨密度和改善骨的微結(jié)構(gòu)，見表2。

表1 各組大鼠脛骨近心干骺端組織計(jì)量學(xué)靜態(tài)參數(shù)Table 1 Histomorphometric indices in the proximal tibia metaphysis of rats

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

表2 各組大鼠血清骨鈣素和抗酒石酸酸性磷酸酶的測(cè)定結(jié)果Table 2 The results of serum OC and TRACP

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，骨的微循環(huán)和血流變功能失衡必然會(huì)導(dǎo)致骨細(xì)胞的能量代謝發(fā)生紊亂，造成骨骼的微結(jié)構(gòu)發(fā)生血液瘀滯，久而久之，骨小梁數(shù)目減少、強(qiáng)度降低，從而造成微骨折[4]。關(guān)于活血化瘀中藥治療骨質(zhì)疏松癥的研究頗多，并發(fā)現(xiàn)其具有重要作用[5]。藥理學(xué)研究也表明，丹參酮ⅡA具有抗氧化、抗凝血、擴(kuò)張血管、改變血液粘滯性、加快血液循環(huán)、改善微循環(huán)、增加心肌供血、抗菌消炎、抗腫瘤等作用[6]。這些功效與活血化瘀治療骨質(zhì)疏松癥的理論相符合。可見用活血化瘀理論治療骨質(zhì)疏松癥是一種有效的方法。此外，莫朝倫等[7]研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA在一定的作用時(shí)間內(nèi)，對(duì)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)具有促增殖分化的作用。葉茂等[8]也發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能是通過抑制成骨細(xì)胞的凋亡。還有研究表明其對(duì)體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞具有抑制作用[9-10]，并能抑制骨吸收及降低骨轉(zhuǎn)換率以延緩或阻斷絕經(jīng)后快速骨丟失[11]，能防止去卵巢大鼠腰椎和脛骨松質(zhì)骨的丟失[12]。此外，丹參酮可以防止以維甲酸誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松模型的骨丟失，其機(jī)制可能與提高激素水平、抑制骨高轉(zhuǎn)換有關(guān)[13]。目前，尚未發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)外關(guān)于丹參酮ⅡA提高動(dòng)物峰值骨量的研究，因此，此研究為開發(fā)預(yù)防與治療骨質(zhì)疏松癥中藥單體新藥奠定了基礎(chǔ)。

有大量研究表明口服淫羊藿苷可通過抑制骨吸收而促進(jìn)骨形成，提高大鼠的峰值骨密度和骨質(zhì)量[14-15]，金雀異黃酮是公認(rèn)的治療骨質(zhì)疏松癥療效的藥物[16]，而口服淫羊藿苷與金雀異黃酮的對(duì)比研究顯示[17]，淫羊藿苷提高骨密度的能力強(qiáng)于金雀異黃酮，而且對(duì)骨硬度的提高能力具有同樣的表現(xiàn)，此研究并將金雀異黃酮藥物濃度(10 mg/kg)通過分子量換算成同樣摩爾濃度的淫羊藿苷(即 25 mg/kg)。因此，將淫羊藿苷作為此研究的陽(yáng)性對(duì)照，并將丹參酮ⅡA的口服劑量用其同樣的方法換算，即為11 mg/kg。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，灌服丹參酮ⅡA兩個(gè)月后，大鼠全身骨密度和離體骨密度都顯著增加，同時(shí)脛骨近端骨小梁的數(shù)量和寬度顯著增加，骨小梁分離度卻顯著減小，表明骨小梁的致密程度明顯增加。血清骨代謝指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果表明，大鼠的骨形成指標(biāo)增加而骨吸收指標(biāo)下降，表明丹參酮ⅡA可能是通過提高骨形成和抑制骨吸收而影響骨代謝，最終導(dǎo)致骨密度增加，骨質(zhì)量明顯提高。上述結(jié)果表明，丹參酮ⅡA可以通過提高峰值骨量而達(dá)到預(yù)防老年性或絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的效果，具有開發(fā)抗骨質(zhì)疏松新藥或先導(dǎo)化合物的潛在價(jià)值。