桔梗皂甙D對人胃癌細胞SGC7901增殖的抑制作用和機制研究

代群 黃宣 陳喆

浙江中醫藥大學附屬第一醫院 杭州 310006

桔梗皂甙D對人胃癌細胞SGC7901增殖的抑制作用和機制研究

代群 黃宣 陳喆

浙江中醫藥大學附屬第一醫院 杭州 310006

[目的]探討桔梗皂甙D（platycodin D，PD）對人胃癌細胞株SGC7901增殖的抑制作用及作用機制。[方法]體外培養人胃癌細胞株SGC7901，加入終濃度分別為5～20μm·L-1的PD。采用MTT法測定藥物對細胞增殖的抑制作用，Annexin V/PI雙標法檢測細胞凋亡率，JC-1檢測線粒體膜電位的變化，Western blot檢測PD對凋亡相關蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP、bcl-2、bax和對MAPK信號通路蛋白ERK、JNK、p38及其磷酸化蛋白p-ERK、p-JNK、p-p38表達的影響。[結果]MTT結果顯示，PD作用24h和48h后，PD對SGC7901細胞增殖的抑制隨濃度的增加而增強；PD作用SGC7901后，細胞凋亡率明顯增加，線粒體膜電位降低。Western blot檢測結果顯示cleaved PARP、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、bax蛋白表達量隨著藥物濃度的增加而升高，bcl-2蛋白表達下降，同時p-JNK、p-p38水平明顯升高，p-ERK蛋白水平下降，ERK、JNK、p38蛋白的表達無明顯變化。[結論]PD對胃癌細胞SGC7901有抑制增殖和誘導凋亡的作用。PD通過抑制ERK信號通路從而抑制細胞增殖，通過激活JNK和p38信號途徑調控bax和bcl-2表達，導致線粒體膜電位下降，進而激活caspase，誘導癌細胞凋亡的發生。

PD；SGC7901；細胞凋亡；線粒體膜電位；bcl-2家族蛋白；MAPK信號通路

胃癌是國內發病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，從分子腫瘤學角度分析，胃癌的發病機制在于腫瘤細胞增殖和凋亡的調控。近年來中藥抗腫瘤研究取得很大進展。桔梗皂苷D（platycodin，PD）是從桔梗中提取的主要活性成分，對多種腫瘤細胞如肺癌[1]、卵巢癌[2]、乳腺癌[3]、前列腺癌[4]等具有抑制增殖和誘導凋亡的作用。PD抗腫瘤活性涉及抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、抑制腫瘤細胞侵襲與轉移[1-4]。絲裂原激活蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase,MAPK）信號傳導途徑，可將細胞外信息傳遞至細胞核中，介導細胞的生存和凋亡，研究證實該信號通路異常與腫瘤發生、發展關系密切[5]。MAPK信號轉導途徑包括ERK、JNK和p38信號通路，其中ERK信號通路主要與細胞的增殖相關[6]，JNK和p38信號通路則主要介導細胞的炎癥和凋亡[7-8]。本研究擬探討PD對人胃癌細胞株SGC7901增殖的抑制作用，及其否通過調控MAPK信號轉導通路發揮抗腫瘤的功效。

1 材料與方法

1.1 材料 PD購自成都曼思特生物科技有限公司(純度＞98%)；胎牛血清購自 Giboc 公司（1227693）；RPMI1640培養液培養基購自科易生物技術有限公司（2016011603）；CCK-8 試劑購自 Dojindo（KM671）；Apoptosis Assay細胞凋亡試劑盒（5306537）和JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒（71926）均購自BD公司；抗體 p-JNK(9255)、JNK(9258)、p-38(9215)、p38(9217)、p-ERK(9101)、ERK(9102)、bax(2772S)、bcl-2(2870)、cleaved PARP(9542S)、cleaved caspase-3(9661S)、cleaved caspase-9（9505S）均購自 Cell Signal公司；β-actin（4970P）及抗兔和抗鼠的二抗均為Santa Cruz公司產品。

1.2 細胞株及細胞培養 人胃癌細胞株SGC7901購自中科院上海細胞生物研究所，含10%胎牛血清的RPMI1640培養液培養，置于37℃、5%CO2恒溫培養箱中。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞增殖抑制實驗 收集對數生長期的SGC7901細胞，以5×104/mL接種于96孔培養板中，每孔 100μL，加入終濃度為 5、10、15、20μm·L-1的PD，每個濃度設平行孔6個，并設立不加PD的空白組作為對照，于37℃,5%CO2培養箱中繼續培養24、48h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，繼續培養箱內孵育4h，酶標儀450nm處檢測OD值，根據OD值計算藥物體外生長抑制率（inhibition rates，IR）和細胞存活率。

1.3.2 細胞凋亡實驗 取對數生長期的SGC7901細胞，按以5×104/mL接種于6孔板，每孔1mL。分別收集 5、10、15、20μm·L-1PD 藥物作用 24h 的細胞以及不加PD藥物的空白組細胞。按試劑盒說明書進行操作，冷PBS緩沖液洗2次，重懸于1×結合緩沖液，調整細胞密度為1×106/L。取100μL細胞懸液加5μL Annexin-V FITC 標記液和 5μL PI(50μm·mL-1)混勻，室溫避光孵育15min后，加400μL結合緩沖液，流式細胞儀檢測，分析細胞凋亡的百分比。

1.3.3 線粒體膜電位的測定PD作用SGC7901細胞24h，收集細胞，PBS洗細胞3次，用去離子水按1:9比例稀釋 10×incubation Buffer為 1×incubation Buffer，混勻并預熱至 37℃，吸取 2.5mL 1×incubation Buffer，加入5μL JC-1 stocking solution，渦旋混勻配成JC-1 working solution，取 500μL JC-1 working solution將細胞均勻懸浮，37℃、5%CO2的培養箱中孵育15min，室溫離心收集細胞，用 1×incubation Buffer洗兩次，吸取500μL 1×incubation Buffer重新懸浮細胞，流式細胞儀檢測線粒體膜電位。

1.3.4 Western-Blot檢測蛋白表達 收集不同濃度PD作用24h的細胞，PBS洗滌2次，加入細胞裂解液100μL，12000r/min離心15min，采用BCA方法測定蛋白濃度，取30μg蛋白，加入上樣緩沖液，100℃下變性10min。10%的聚丙烯酰胺SDS凝膠電泳后，電轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉后依次加入第一、二抗體，在室溫下孵育2h，TBST緩沖液洗滌3次，每次10min，過氧化物酶法顯色，凝膠顯微成像系統處理，采用Quantity one軟件分析結果。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0進行統計，各組數據采用±s表示，兩組間數據比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統計意義。

2 結果

2.1 PD對SGC7901細胞的增殖抑制作用 5、10、15、20μm·L-1濃度的 PD 處理 SGC7901細胞 24h和48h，PD對細胞增殖的抑制作用（表1），細胞存活率（圖1）。結果顯示PD對胃癌細胞SGC7901的抑制作用呈現明顯的劑量效應關系，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 PD對SGC7901細胞增殖的抑制作用（%，±s，n=3）Tab.1 Inhibitory effect of PD on the proliferation of SGC7901（%，±s，n=3）

表1 PD對SGC7901細胞增殖的抑制作用（%，±s，n=3）Tab.1 Inhibitory effect of PD on the proliferation of SGC7901（%，±s，n=3）

注：與空白組比較，*P＜0.05,**P＜0.01。Note:Compared with the blank group*P＜0.05,**P＜0.01.

時間40.2±7.6**59.8±10.3**10 15 20 24h 48h PD（μm·L-1）0 5 0 0 6.8±3.4 11.6±5.4 15.3±8.2*26.8±6.3*35.2±9.5**49.6±9.4**

圖1 PD對胃癌細胞SGC7901增殖存活率的影響Fig.1 Effect of PD on survival rate of gastric cancer cell SGC7901proliferation

2.2 PD誘導SGC7901細胞凋亡的作用 收集不同濃度PD處理24h的SGC7901細胞細胞，并用AnnexinV FITC/PI試劑標記，5、10、15、20μm·L-1PD誘導細胞的早期凋亡率分別為（8.3±3.6）%、（15.9±4.2）%、（31.2±5.3）%、（39.6±5.2）%，與空白組凋亡率（2.5±1.2）%相比，細胞凋亡率明顯增加，見圖 2A；10、15、20μm·L-1PD與空白組比較差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），見圖 2B。

2.3 PD對SGC7901細胞線粒體膜電位的影響 SGC7901細胞經 5、10、15、20μm·L-1PD 作用 24h 后，線粒體膜電位分別是 （87.6±4.9）%、（82.7±6.8）%、（56.7±5.7）%和（36.4±6.3）%，與空白組線粒體膜電位（94.2±1.8）%比較，結果顯示隨PD濃度的增加，線粒體膜電位降低，見圖 3A；10、15、20μm·L-1PD 與空白組比較差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），見圖 3B。

圖2 A PD誘導SGC7901細胞凋亡的作用Fig.2A The effect of PD on apoptosis of SGC7901

圖2 B PD誘導細胞凋亡率的統計分析Fig.2B Statistical analysis of PD on apoptosis rate

圖3 A PD對SGC7901細胞線粒體膜電位的影響Fig.3A Effects of PD on mitochondrial membrane potential of SGC7901

圖3 B PD對細胞線粒體膜電位的統計分析Fig.3B Statistical analysis of PD on mitochondrial membrane potential

2.4 PD對caspase相關蛋白的影響 Western-blot實驗結果顯示PD作用SGC7901細胞24h后，隨著藥物濃度增加，cleaved PARP、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白濃度逐漸增加，（圖4A）。半定量分析結果顯示隨著藥物濃度的增高，PD對cleaved PARP、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9 蛋白的作用逐漸增強，15和20μm·L-1濃度的PD與空白組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），（圖 4B）。結果表明PD可以活化 caspase-3和caspase-9蛋白酶，形成cleaved caspase-3和cleaved caspase-9，進而降解底物生成cleaved PARP，參與細胞凋亡的發生。

2.5 PD對SGC7901細胞bcl-2和bax蛋白表達的影響 不同濃度的PD作用SGC7901細胞24h后，Western blot方法檢測結果顯示bax蛋白表達水平隨藥物濃度的增加而增加，而bcl-2蛋白表達水平逐漸降低，（圖5A）。半定量分析結果顯示隨著藥物濃度的增高，PD對bax、bcl-2蛋白的作用逐漸增強，15和20μm·L-1濃度的PD與空白組比較，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），（圖 5B）。結果表明 PD 可以作用bcl家族蛋白誘導細胞凋亡的發生。

2.6 PD對MAPK信號通路關鍵蛋白的作用 PD處理SGC7901細胞24h，Western blot方法檢測結果顯示p-JNK和p-p38增加，JNK、p38蛋白表達變化不明顯，表明PD激活了JNK、p38信號轉導通路。p-JNK和p-p38升高的同時，p-ERK表達下降，表明PD通過降低ERK的活性抑制SGC7901細胞的增殖，（圖6A）。半定量分析結果顯示隨著藥物濃度的增高，JNK、p38、ERK蛋白表達無明顯差異，而對p-JNK、p-p38、p-ERK 蛋白的作用逐漸增強，15 和20μm·L-1濃度的PD與空白組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），（圖6B）。結果表明PD可以抑制 ERK信號，同時激活JNK和p38信號途徑。

圖4 A PD對SGC7901細胞caspase相關蛋白的作用Fig.4A Effects of PD on caspase protein in SGC7901 Cells

圖4 B PD對caspase相關蛋白作用的半定量分析Fig.4B Semi-quantitative analysis of PD on caspase protein

圖5 A PD對SGC7901細胞凋亡相關蛋白bcl-2和bax的影響Fig.5A Effects of PD on apoptosis related protein bcl-2 and bax in SGC7901 Cells

圖5 B PD對bcl-2和bax蛋白的半定量分析Fig.5B Semi-quantitative analysis of PD on protein bcl-2 and bax

圖6 A PD對MAPK信號通路關鍵蛋白的影響Fig.6A Effects of PD on important proteins of MAPK signaling pathway

圖6 B PD對MAPK信號通路關鍵蛋白作用的半定量分析Fig.6B Semi-quantitative analysis of PD on important proteins of MAPK signaling pathway

3 討論

PD是常用傳統中藥桔梗的主要活性成分之一，近年來國內外對其在體內體外研究逐漸增多。PD不僅在抗炎鎮痛、調節免疫方面表現出良好的藥理活性，大量文獻報道PD也有抑制腫瘤細胞增殖的作用[1-4]。本研究結果顯示PD對胃癌細胞株SGC7901有抑制生長的作用，呈濃度依賴性，流式檢測結果也證實PD體外有誘導細胞凋亡的作用。

線粒體膜電位的破壞是細胞凋亡早期發生的一個標志性事件。bcl-2家族蛋白是重要的細胞線粒體凋亡調節因子，包括抑制和促進細胞凋亡兩類功能相反的蛋白質，蛋白成員間的相互作用對線粒體介導的細胞凋亡起調控作用。抗凋亡蛋白bcl-2與結合在線粒體外膜面或存在于胞漿的促凋亡蛋白bax、bak等相互作用，引起線粒體膜通透性改變和跨膜電位丟失。細胞受到凋亡誘導后線粒體膜電位的變化使得膜的通透性發生改變。膜通透性的增加，使得線粒體蛋白包括細胞色素C、核酸內切酶、凋亡誘導因子等從線粒體基質釋放到細胞漿。細胞色素C的釋放伴隨膜電位的完全喪失，進而引發細胞凋亡酶的級聯效應。本實驗應用JC-1染色，通過流式細胞儀檢測線粒體膜電位的變化，發現隨著藥物濃度的增加，胃癌細胞線粒體膜電位逐漸下降；實驗結果證實PD通過調控bcl-2、bax蛋白表達的改變引發線粒體膜電位的下降，激活caspase導致細胞凋亡。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，將細胞外刺激信號轉導至細胞及其核內，在細胞增殖、分化、轉化及凋亡等的過程中具有至關重要的作用。已有文獻報道PD通過激活MAPK信號通路和EGFR介導的Akt通路發揮抑制乳腺癌生長、遷移、侵襲的作用[9]；也有研究發現PD通過激活p38信號通路誘導胃腺癌ACS凋亡和線粒體凋亡[10]。MAPK信號通路包括ERK、JNK/SAPK和P38信號途徑。其中ERK信號途徑與細胞增殖相關，JNK/SAPK和p38信號途徑通過誘導bcl-2和bax線粒體轉位，調控細胞凋亡。為了深入探討PD誘發SGC7901細胞凋亡的可能的信號轉導通路，本實驗檢測MAPK信號途徑中的關鍵蛋白。結果發現在PD作用下，磷酸化的JNK、p38表達升高，說明PD通過激活JNK和p38信號通路誘導胃癌細胞的凋亡。ERK的活性增強與細胞生長密切相關，隨著藥物濃度的增高，磷酸化的ERK表達下降，表明PD通過調控ERK蛋白活性的降低發揮抑制胃癌細胞增殖的作用。綜上，PD能抑制胃癌細胞的增殖，通過抑制ERK信號通路從而抑制細胞增殖，通過激活JNK和p38信號途徑調控bax和bcl-2表達，導致線粒體膜電位下降，進而激活caspase，誘導細胞凋亡。

References:

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[2] Hu Q,Pan R,Wang L,et al.Platycodon grandiflorum induces apoptosis in SKOV3 human ovarian cancer cels through mitochondrial-dependent pathway[J].Am J Chin Med,2010,38(2):373-386.

[3] Yu JS,Kim AK.Platycodin D induces apoptosisin MCF-7 human breast cancer cells[J].J Med Food,2010,13(2):298-305.

[4] Zhou R,Lu Z,Liu K,et al.Platycodin D induces tumor growth arrest by activating FOX03a expression in prostate cancer in ivitro and in vivo[J].Curr Cancer Drug Target,2015,14(9):860-871.

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[6] Chen HX,Xu XX,Tan BZ,et al.MicroRNA-29b InhibitsAngiogenesisbyTargetingVEGFA through the MAPK/ERK and PI3K/Akt Signaling Pathways in Endometrial Carcinoma[J].Cell Physiol Biochem,2017,41(3):933-946.

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[9] Chun J,Kim YS.Platycodin D inhibits migration,invasion,and growth of MDA-MB-231 human breast cancer cells via suppression of EGFR-mediated Akt and MARK pathways[J].Chem Biol Interact,2013,205(3):212-221.

[10] Chun J,Joo EJ,Kang M,et al.Platycodin D induces anoikis and caspase-mediated apoptosis via p38 MAPK in ACS human gastri cancer cells[J].J Cell Biochem,2013,114(2):456-470.

Inhibitory Effect of Platycodin D on Proliferation of SGC7901 Cells and Moleclar Mechanism

DAI Qun,HUANG Xuan,CHEN Zhe First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053)

[Objective]To investigate the effects of platycodin D(PD)on the proliferation and apoptosis of human stomach cancer SGC7901 and the related mechanism.[Methods]SGC7901 was cultured in virto and was treated with 5～20μm·L-1concentrations of PD.Cell proliferation was examined by MTT assay.Cell apoptosis was detected by Annexin V FITC/PI double staining.The change of mitochondrial trans-membrane potential was measured by JC-1 staining.The potein expression of cleaved caspase-3,cleaved caspase-9,cleaved PARP,bcl-2,bax,p-ERK,ERK,p-JNK,JNK,p-p38 and p38 detected by Western blot.[Results]MTT results showed that PD inhibited the growth of SGC7901 cells in a dose-dependent manner at 24h and 48h.SGC7901 cells treated with PD for 24h showed significantly enhanced apoptosis and weakened mitochondrial membrane potential compared with the control cells.Western blot results showed that PD could up-regulate expression of cleaved PARP,cleaved caspase-3,cleaved caspase-9,bax,p-JNK,p-p38 protein,decreased bcl-2,p-ERK protein,the expression of ERK,JNK,p38 protein did not change significantly.[Conclusion]PD may inhibit the proliferation and induce the apoptosis of SGC7901 cells.These findings indicated that PD inhibited cell proliferation by inhibiting the ERK signaling.PD effect on bax and bcl-2 by activation of JNK and p38 signaling pathway resulted in the decrease of mitochondrial membrane potential and activation of caspase,which induced the apoptosis of cancer cells.

PD;SGC7901 cell apoptosis;mitochondrial membrane potential;bcl-2 family protein;MAPK signal pathway

R331

A

1005-5509（2017）07-0573-07

10.16466/j.issn1005-5509.2017.07.005

2017-03-16）

國家自然科學基金項目（81673745）

Fund project:National Natural Science Fund(81673745）

黃宣，E-mail：huangxuan1976@163.com