結核分枝桿菌膜囊泡的分離及其對細胞因子釋放的作用

呂翎娜 賈紅彥 廖莎 武劍楠 孫照剛 張宗德

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·論著·

結核分枝桿菌膜囊泡的分離及其對細胞因子釋放的作用

呂翎娜 賈紅彥 廖莎 武劍楠 孫照剛 張宗德

目的 分離體外培養的結核分枝桿菌分泌的膜囊泡，檢測其形態和粒徑分布，初步探索結核分枝桿菌膜囊泡對巨噬細胞中細胞因子釋放的作用。 方法 采用結核分枝桿菌實驗室標準菌株H37Rv，通過7H9培養基復蘇、擴大培養標準株H37Rv至對數生長期，菌體全部接種于蘇通培養基中繼續培養3周，離心取上清，超濾濃縮結合超速離心分離提取結核分枝桿菌H37Rv膜囊泡，通過透射電鏡觀察膜囊泡的大小、形態，采用納米顆粒跟蹤儀分析膜囊泡的粒徑及分布。同時，設置不處理對照組、H37Rv感染組[按照感染復數(multiplicity of infection，MOI)=20∶1]和H37Rv膜囊泡處理組(按照膜囊泡∶細胞=100∶1)處理佛波酯(50 ng/ml)誘導貼壁的單核巨噬細胞(THP-1)4 h，更換新鮮培養基后0 h、4 h、8 h、24 h收集細胞培養上清，采用Milliplex多細胞因子檢測試劑盒檢測細胞因子的釋放情況，通過曼-惠特尼U(Mann-WhitneyU)檢驗對各時間點H37Rv膜囊泡處理組和不處理對照組之間腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素10(IL-10)釋放量進行比較，以P<0.05為差異有統計學意義。 結果 按照調整后的提取方法得到的提取物中可檢測到H37Rv分泌的膜囊泡，平均粒徑為137 nm，主要分布在30～510 nm之間，<250 nm的膜囊泡數量占總量的96.88%。4 h、8 h和24 h 的TNF-α、IL-6和IL-1β釋放量與不處理對照組[分別為348.19(333.99，360.47) pg/ml、412.38(406.67，418.79) pg/ml、324.44(316.11，331.14) pg/ml；3.01(2.81，3.02) pg/ml、5.40(5.26，5.83) pg/ml、13.22(11.80，13.77) pg/ml；118.92(113.97，122.47) pg/ml、132.33(125.87，137.62) pg/ml、169.31(167.75，172.49) pg/ml]相比，H37Rv膜囊泡處理組[分別為507.33(501.80，513.84) pg/ml、4483.00(4130.75，4522.50) pg/ml、8170.00(8058.25，8206.75) pg/ml；12.88(12.04，13.84) pg/ml、68.51(66.88，69.77) pg/ml、335.44(331.02，340.64) pg/ml；800.57(791.18，809.60) pg/ml、1559.00(1546.00，1566.00) pg/ml、4316.50(4094.75，4389.75) pg/ml]均明顯增加，差異均有統計學意義(U值均<0.001，P值均<0.01)；但4 h、8 h和24 h的IL-10釋放量[不處理對照組分別為1.23(1.21，1.31) pg/ml、1.56(1.31，1.82) pg/ml、5.41(4.99，5.89) pg/ml；H37Rv膜囊泡處理組分別為4.56(4.49，4.82) pg/ml、1.43(1.28，1.89) pg/ml、1.56(1.48，1.68) pg/ml]差異均無統計學意義(U值分別為6.00、17.00、7.00，P值分別為0.065、0.898和0.087)。 結論 本研究建立了結核分枝桿菌膜囊泡分離提取的技術流程，可以得到純度較好、形態完整、粒徑正常的膜囊泡。同時，結核分枝桿菌膜囊泡可以誘發巨噬細胞中細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的釋放。

分枝桿菌, 結核； 細胞因子類； R-SNARE蛋白質類； 細胞學技術； 膜囊泡

近年來，進化高度保守、普遍存在于多種生物體的細胞外膜泡這一分泌途徑被發現。結核分枝桿菌也可以在宿主細胞內或體外培養條件下主動分泌膜囊泡(membrane vesicles，MV)，直徑為50～300 nm，攜帶著多種病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，如蛋白質、脂類和核酸等，可被宿主細胞攝入，調控細胞免疫反應，誘導多種促炎因子和細胞因子的釋放[1-3]。研究發現，結核分枝桿菌膜囊泡可通過Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)依賴的方式調控小鼠巨噬細胞多種炎癥因子，以及參與早期結核性肉芽腫形成的蛋白基質金屬蛋白酶9(MMP-9)和環氧合酶2(Cox-2)的表達；膜囊泡注射過的小鼠再次感染結核分枝桿菌后，小鼠肺部具有更嚴重的炎癥反應，且荷菌量增加，表明膜囊泡與結核病的發生、發展密切相關[2]。結核分枝桿菌膜囊泡具有很強的免疫原性，不需要佐劑便可誘導機體產生等同于卡介苗(BCG)的免疫保護效果[4]；此外，結核分枝桿菌膜囊泡中含有特異度和敏感度較高的結核抗原，有望作為結核病診斷的分子標識[5]。

然而，結核分枝桿菌膜囊泡的研究尚處于初始階段，對其分離方法及功能有待探索和研究。因此，作者通過借鑒國外文獻報道的方法摸索建立了一套穩定有效的膜囊泡分離提取流程及形態表征方法，并且初步探索研究了結核分枝桿菌膜囊泡對巨噬細胞的細胞因子釋放的作用。

材料和方法

一、菌株和細胞系

本實驗采用結核分枝桿菌實驗室標準菌株H37Rv，由國家結核病臨床參比實驗室提供；細胞系采用人源單核巨噬細胞系(THP-1)，購自北京協和細胞庫。

二、儀器和試劑

1. 儀器：Amicon 8400型超濾裝置(美國Merk Milipore公司)、MX120/150超速離心機(美國Thermo Fisher公司)、NanoSight NS300納米顆粒跟蹤儀(英國Malvern儀器有限公司)、JEM-1400型透射電鏡(美國FEI公司)。

2. 試劑：7H9培養基(美國BD公司)、RPMI-1640培養基(美國Gibco公司)、胎牛血清(美國Hyclone公司)、蘇通培養基配制試劑(成分包括：天門冬素、檸檬酸、磷酸氫二鉀、檸檬酸鐵銨、硫酸鎂、甘油，均購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司)、Milliplex多細胞因子檢測試劑盒(美國Merk Milipore公司)。

三、結核分枝桿菌膜囊泡的收集、提取

結核分枝桿菌培養液中膜囊泡的分離方法參考文獻[2]并有所調整：7H9液體培養基(含10%促生長添加劑OADC、0.5%吐溫-80)復蘇、擴大培養H37Rv，至600 nm處吸光度值(A600)≈1.0，離心收集H37Rv菌體，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次后接種于蘇通基本培養基(成分包括：天門冬素4 g/L、枸櫞酸鹽2 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、七水合硫酸鎂0.5 g/L、枸櫞酸鐵銨0.5 g/L、甘油5%，pH=7.2)中，繼續培養3周。3450×g離心20 min收集上清，使用0.22 μm濾器過濾除菌、Amicon超濾裝置濃縮收集相對分子質量在100 000以上蛋白質的液體(包含膜囊泡)。依次以4000×g、15 000×g，4 ℃ 各離心15 min，最后以120 000×g超速離心4 h，棄上清，PBS洗滌膜囊泡沉淀2次。根據后續實驗目的不同加入合適的緩沖液重懸膜囊泡沉淀，-80 ℃保存。

四、結核分枝桿菌膜囊泡形態表征

1. 透射電鏡觀察：用2%的戊二醛(溶解在0.1 mol/L 的二甲胂酸)室溫固定膜囊泡2 h，繼續在4%多聚甲醛、1%戊二醛、0.1% PBS中孵育過夜。固定好的樣品在四氧化鋨中染色90 min，乙醇脫水后包埋在Spurr環氧樹脂上，采用Ultracut UCT切片機(美國Reichert公司)切成薄片后用0.5%醋酸雙氧鈾和0.5%檸檬酸鉛染色。采用中國科學院微生物研究所儀器共享平臺的JEM-1400型透射電鏡在80 kV下觀察。

2. 納米顆粒跟蹤儀檢測：采用英國Malvern儀器有限公司的納米顆粒跟蹤儀NanoSight NS300進行觀察。將合適濃度的膜囊泡(稀釋液為PBS)經注射器注入分析室，調整參數使視野內膜囊泡分布均勻，密度一致，對視野內囊泡進行錄像，通過納米顆粒跟蹤分析軟件(nanoparticle tracking analysis，NTA)單獨記錄視頻中每一個膜囊泡的布朗運動，自動定位并跟蹤其中心運動的軌跡，計算平均位移，繪制出顆粒散射光強-粒徑-數量分布強度的三維圖譜，該技術同步跟蹤所有顆粒，得到顆粒粒徑的數量分布信息。

五、結核分枝桿菌膜囊泡處理巨噬細胞系

H37Rv培養至對數生長期，離心收集菌體并用PBS清洗。同時分離上清中膜囊泡，通過NanoSight NS300納米顆粒跟蹤儀測其濃度。佛波酯(50 ng/ml)誘導THP-1細胞系48 h后，用無血清培養基RPMI 1640按照感染復數(multiplicity of infection，MOI)=20∶1(細菌∶細胞)的比例處理細胞，作為結核分枝桿菌H37Rv感染組(陽性參照)。膜囊泡按照100∶1(膜囊泡∶細胞)的比例處理細胞[2]，作為H37Rv膜囊泡處理組，同時設置不處理對照組。4 h后換新鮮培養基，繼續培養0、4、8、24 h；在相應時間點收集上述細胞培養液進行細胞因子釋放實驗。

六、Milliplex多細胞因子檢測試劑盒檢測細胞因子釋放

按照試劑盒(Millipore，貨號：HCYTOMAG-60K，批號：HCY-108和 HCY-208)說明書對細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10進行檢測，反應結束后，將孔板放入多功能流式點陣儀Luminex 200讀取數據。采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，對各時間點膜囊泡處理組和不處理組之間各細胞因子數值的比較采用曼-惠特尼U(Mann-WhitneyU)檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、結核分枝桿菌膜囊泡分離方法及形態表征

本方法在原文獻報道方法的基礎上做了調整，具體調整條件見表1。H37Rv在7H9培養基中擴大培養至對數生長期(A600≈1.0)，離心收集菌體并全部接種至蘇通培養基繼續培養3周，離心去除菌體并收集上清，0.22 μm濾器過濾除菌，采用相對分子質量為100 000的孔徑膜經超濾杯超濾濃縮至約50 ml，4000×g、15 000×g依次離心15 min、30 min去除細胞碎片和大分子蛋白復合物，最后通過120 000×g離心4 h超速離心收集結核分枝桿菌H37Rv膜囊泡，經PBS清洗兩次獲得純度較好的膜囊泡。

通過檢測膜囊泡的結構和粒徑分布進行形態表征，透射電鏡結果顯示(中國科學院微生物研究所儀器共享平臺)，提取方法調整前，提取物中觀測不到結核分枝桿菌H37Rv膜囊泡，且細胞碎片等雜質較多；提取方法調整后，提取物中觀測到結核分枝桿菌H37Rv膜囊泡，且大小均一，呈圓形囊泡結構，直徑約100 nm(圖1)。NanoSight NS300納米顆粒追蹤儀檢測結果顯示，結核分枝桿菌H37Rv膜囊泡粒徑峰值為117 nm，平均粒徑137 nm，主要分布在30～510 nm之間，<250 nm的膜囊泡數量占總量的96.88%(圖2，表2)。

二、結核分枝桿菌膜囊泡處理巨噬細胞系后對細胞因子釋放的作用

為了初步檢測結核分枝桿菌H37Rv膜囊泡的功能，本研究采用Milliplex多細胞因子檢測試劑盒，檢測了H37Rv及其膜囊泡處理的THP-1人源單核巨噬細胞中4種細胞因子的釋放，包括TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10。結果顯示，與不處理對照組相比，H37Rv分泌的膜囊泡處理THP-1人源巨噬細胞后，培養上清中細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的水平在4 h、8 h和24 h均明顯增加，差異均有統計學意義(U值均<0.001，P值均<0.01)；而膜囊泡處理組4 h、8 h和24 h培養上清中IL-10水平與不處理對照組相比，差異均無統計學意義(U值分別為6.00、17.00、7.00，P值分別為0.065、0.898和0.087)(表3)。

表1 膜囊泡提取條件調整情況

注 左圖為提取方法調整前，右圖為提取方法調整后；按照文獻[2]報道的方法及摸索條件后調整的方法分別提取結核分枝桿菌H37Rv膜囊泡，透射電鏡觀察膜囊泡形態及結構；圖中尺度標記代表100 nm圖1 透射電鏡觀察結核分枝桿菌H37Rv膜囊泡

注 對提取的膜囊泡進行粒徑及其分布的分析，橫軸代表粒徑大小，左側縱軸代表微粒濃度，右側縱軸代表累積百分比；累積百分比代表某一粒徑的微粒累積占所有微粒的百分比，最終達到100.00%圖2 NanoSight NS300顆粒跟蹤儀的結核分枝桿菌H37Rv膜囊泡粒徑分析情況

表2 結核分枝桿菌H37Rv膜囊泡粒徑分析報告

討 論

巨噬細胞是固有免疫應答反應中最主要的細胞，是機體抵抗結核感染的第一道防線。同時，巨噬細胞又是結核分枝桿菌在體內滯留，造成潛伏性結核感染的主要場所[6-7]。全球近1/3的人口感染過結核分枝桿菌，只有約10%的個體在感染結核分枝桿菌后發展為活動性結核病[8]。絕大多數情況下，結核分枝桿菌與宿主免疫應答保持平衡狀態，無結核病臨床癥狀[9]。因此，結核分枝桿菌與巨噬細胞的相互作用影響機體發生結核感染后的結局。病原菌產生的細胞外膜泡在調節病原菌與宿主的相互作用中發揮重要作用[10]。結核分枝桿菌膜囊泡的發現對研究病原菌與宿主間的相互作用提示了新的方向。

本研究在借鑒國外文獻的基礎上，摸索并建立了一套穩定有效的膜囊泡分離提取流程及形態表征方法，可重復多次提取得到形態完整并適合后續實驗(如細胞因子釋放試驗)的膜囊泡。按照原文獻方法，本課題組無法分離得到理想的膜囊泡。原提取方法中，培養細菌和收集膜囊泡的培養液都是基本培養基，雖然可以降低后期提取膜囊泡的雜質含量，但也會由于結核分枝桿菌生長速率較低導致培養時間增加，且總菌量較低使得提取時膜囊泡獲得率較低。本課題組將培養細菌的培養基調整為可實現結核分枝桿菌快速增長的7H9培養基，快速獲得大量菌體后，再將菌體全部接種于成分簡單的蘇通基本培養基中收集膜囊泡，這樣不但縮短了培養時間，菌量的增加也使得提取時膜囊泡獲得率提高，再通過增加超速離心力120 000×g(原方法為100 000×g)和離心時間4 h(原方法為1 h)，均可以提高膜囊泡的提取效率，例如原文獻使用1000 ml以上的培養液提取膜囊泡，本實驗采用500 ml的培養上清就可以提取得到完整的、足量的膜囊泡。此外，本提取方法用0.22 μm濾器過濾代替原方法的0.45 μm濾器，這樣可以過濾掉除菌體以外的其他大分子雜質。本方法還增加了對膜囊泡沉淀進行PBS清洗的過程，這也可以提高膜囊泡的純度。本研究還通過結核分枝桿菌H37Rv膜囊泡處理THP-1人源單核巨噬細胞模型，初步探索發現結核分枝桿菌H37Rv膜囊泡對宿主細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的釋放具有促進作用，這與既往研究報道結果一致[2]，而對IL-10的釋放無明顯影響。IL-6是參與肺結核患者抗感染免疫的重要調節因子[11]，因此，結核分枝桿菌可能通過膜囊泡遠程調控未受感染的巨噬細胞中炎性因子的釋放。TNF-α是巨噬細胞感染結核分枝桿菌后通過自分泌或旁分泌的方式介導細胞凋亡途徑的主要細胞因子[12]。IL-1β是參與細胞凋亡相關的炎癥因子[13]。這提示結核分枝桿菌可能通過分泌膜囊泡在細胞凋亡過程中發揮一定作用。IL-10是抑制巨噬細胞釋放發熱的炎性因子，阻止抗原遞呈而發揮特異性免疫效應[14]。結核分枝桿菌H37Rv膜囊泡不能像結核分枝桿菌菌體那樣促進IL-10釋放，原因可能是膜囊泡中缺乏觸發IL-10釋放的生物活性分子，具體機制有待進一步研究。

表3 H37Rv標準株及其膜囊泡處理巨噬細胞后不同時間點細胞因子水平[pg/ml，M(Q1，Q3)]

注 H37Rv感染組僅作為陽性參照，無需進行比較

綜上所述，本研究建立了結核分枝桿菌膜囊泡的提取方法，并初步探索了膜囊泡對巨噬細胞相關細胞因子釋放的作用，研究結果為深入開展結核分枝桿菌和宿主細胞間相互作用提供了新思路，為揭示結核分枝桿菌的致病機制奠定了理論基礎。

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(本文編輯：郭萌)

Isolation of mycobacterial membrane vesicles and preliminary investigation of their functions

LYüLing-na，JIAHong-yan，LIAOSha，WUJian-nan，SUNZhao-gang,ZHANGZong-de.

BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity，BeijingKeyLaboratoryforDrugResistantTuberculosisResearch,BeijingTuberculosisandThoracicTumorResearchInstitute,Beijing101149,China

ZHANGZong-de,Email:zzd417@163.com

Objective To isolate mycobacterial membrane vesicles (MV), examine their morphology and size distribution, and explore their roles in cellular cytokine release. Methods The H37Rv strain ofM.tuberculosiswas cultured in Middlebrook 7H9 medium supplemented with 10% (v/v) OADC enrichment until it reached an OD600≈1.0. It was then cultured in Sauton’s medium for a further 3 weeks. Cultures were harvested and vesicles were isolated by a combining concentration by ultrafiltration and ultracentrifugation. Transmission Electron Microscopy (TEM) was used to analyze the morphology and integrity of MV, and NanoSight NS300 was used to deter-ming the absolute size distribution of MV. To investigate cellular cytokine release, THP-1 cell were treated with PMA (50 ng/ml) for 48 h, and further incubated for 4 h (negative control, NC) or treated with H37Rv (MOI=20∶1) or its MV (MV∶Cell=100∶1) for 4 h. After incubating in fresh medium for 0, 4, 8, or 24 h, the supernatant was harvested and cytokine release was assayed using Milliplex MAP Kits according to the manufacturer’s instructions. The Mann-WhitneyUtest was used to analyze the difference between paired samples,P<0.05 being considered statistically significant. Results MV secreted here by the H37Rv strain were vesicular and intact. The size distribution of MV was between 30 and 510 nm, and the average size was 137 nm; 96.88% of vesicles were under 250 nm in diameter. Release of TNF-α, IL-6 and IL-1β by THP-1 cells treated with MV for 4, 8, and 24 h increased with time (507.33 (501.80，513.84) pg/ml, 4483.00 (4130.75，4522.50) pg/ml, 8170.00 (8058.25，8206.75) pg/ml; 12.88 (12.04，13.84) pg/ml, 68.51 (66.88，69.77) pg/ml, 335.44 (331.02，340.64) pg/ml; 800.57 (791.18，809.60) pg/ml, 1559.00 (1546.00，1566.00) pg/ml, 4316.50 (4094.75，4389.75) pg/ml) compared with the negative control (348.19 (333.99，360.47) pg/ml, 412.38 (406.67，418.79) pg/ml, 324.44 (316.11，331.14) pg/ml; 3.01 (2.81，3.02) pg/ml, 5.40 (5.26，5.83) pg/ml, 13.22 (11.80，13.77) pg/ml; 118.92 (113.97，122.47) pg/ml, 132.33 (125.87，137.62) pg/ml, 169.31 (167.75，172.49) pg/ml) (allU<0.001, allP<0.01). However, there was no significant change in IL-10 in the negative control (1.23 (1.21，1.31) pg/ml, 1.56 (1.31，1.82) pg/ml, 5.41 (4.99，5.89) pg/ml) or MV-treated THP-1 cells (4.56 (4.49，4.82) pg/ml, 1.43 (1.28，1.89) pg/ml, 1.56 (1.48，1.68) pg/ml) (U=6.00, 17.00 and 7.00;P=0.065, 0.898 and 0.087 respectively). Conclusion We have established a technical procedure for isolating mycobacterial MV with which we can obtain pure and intact vesicles. In addition, we have demonstrated that mycobacterial MV play a role in TNF-α, IL-6 and IL-1β release from infected THP-1 macrophages.

Mycobacteriumtuberculosis； Cytokines； R-SNARE proteins； Cytological techniques； Membrane vesicles

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.003

北京市自然科學基金(5174035)；“十二五”國家科技重大專項(2015ZX10004801-003)；重大傳染病防治協同創新中心項目(PXM2015_014226_000058，PXM2016_014226_000052)；北京市醫院管理局臨床醫學發展專項(ZYLX201304)；北京市優秀人才培養項目(201500002146G188)

101149 首都醫科大學附屬北京胸科醫院 耐藥結核病研究北京市重點實驗室 北京市結核病胸部腫瘤研究所

張宗德，Email：zzd417@163.com

2017-05-09)