中國漢族人群白癜風6q27區域易感基因精細定位研究

高 敏 李增剛 鄭曉東 周伏圣 唐先發

?

·論著·

中國漢族人群白癜風6q27區域易感基因精細定位研究

高 敏 李增剛 鄭曉東 周伏圣 唐先發

目的： 對中國漢族人群白癜風6q27易感區域進行精細定位研究，以期發現白癜風易感基因。方法： 收集2942例白癜風患者和2850名正常對照標本，對6q27易感區域內的24個標簽SNP位點進行基因分型。采用Plink 1.07和SPSS19.0軟件進行統計分析,同時進行條件回歸分析和連鎖不平衡分析。結果： (1)SNP位點rs2236313、rs9457258、rs720325、rs968334、rs3093025、rs55802221、rs1012656、rs6930998和rs1331299的等位基因頻率在病例組和對照組之間具有顯著差異，但是通過條件回歸分析結果提示沒有新的獨立信號存在；(2)連鎖不平衡分析結果顯示rs2236313、rs9457258、rs720325、rs968334和rs30930255位點間具有中度連鎖關系(D'>0.7，r2>0.4)。結論： 本文證實既往報道的SNP是標簽SNP，根據基因型填補以后的注釋結果認為白癜風6q27區域的關聯基因為RNASET2基因。

白癜風； 易感基因； 精細定位

白癜風(Vitiligo)是一種常見的色素脫失性疾病。本病多為后天發生，臨床主要表現為受累部位出現境界清晰、大小不等、形態各異的色素脫失斑。除皮膚外，毛發以及黏膜部位均可累及[1]。本病極度影響美觀，給患者身心帶來嚴重負擔。目前為止，關于白癜風的發病機制有黑素細胞自毀學說、神經學說、自身免疫學說和遺傳學說等，但是具體發病原因并不明確。近年來，根據國內外學者的研究，多認為白癜風是一種復雜疾病，遺傳和環境因素共同作用導致白癜風的發生和發展[2]。

目前隨著大通量基因分型技術、分子生物學技術和生物信息學技術的飛速發展，許多學者對白癜風發病的遺傳學因素進行了深入研究[3,4]。2010年，本課題組利用全基因組關聯分析的方法在中國漢族人群中發現了一個新的白癜風易感位點，即在染色體6q27存在一個約200 kb的區域與白癜風易感性顯著相關[5]。該研究結果得到國內外學者的認可，因此對6q27區域進行精細定位研究，進一步縮小易感區域，對發現白癜風易感基因以及在分子遺傳學水平上闡明白癜風的發病機制具有重要意義。本研究在前期研究的基礎上，對該區域內利用基因型填補(imputation)的方法和質量控制處理后，篩選出24個標簽SNP位點進行進一步基因分型、連鎖不平衡分析和條件回歸分析，以期對白癜風易感區域進一步定位，為尋找其易感基因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本研究收集2942例白癜風樣本，其中男1629例和女1313例；平均年齡為(28.38±14.60)歲。所有患者均經伍德燈檢測，根據白癜風的診斷標準由至少兩位皮膚科副主任醫師或以上專家確診。正常對照樣本為2850名(其中男1572名和女1278名；平均年齡為33.97±13.70歲)，均來自皮膚科門診就診的非白癜風患者，其一、二、三級親屬也都要求不能患有白癜風，且不能伴有其他自身免疫性疾病或是其他系統性疾病。專門的調查員對患者和對照進行問卷調查，收集相關信息。本研究獲得安徽醫科大學倫理委員會批準并符合赫爾辛基宣言原則。在患者和對照人員知情同意的情況下采集外周靜脈血3～4 mL，放置于5 mL的EDTANa2抗凝管中，-80℃冰箱儲存。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA的提取和標準化 用Flexi Gene DNA提取試劑盒按照產品操作說明書提取樣本基因組DNA，經檢測其濃度后，標準化至15～20 ng/μL，并放置于-20℃冰箱保存備用。

1.2.2 SNP位點篩選 根據前期GWAS研究結果，做基因型推算(imputation)處理，結果得到98975個SNPs；其次進行質量控制，以infor≥90%為選取條件，剩余15427個SNPs；對于該區域內所有位點利用HaploReg2數據庫進行基因和功能注釋，再將這些位點在Blood eQTL數據庫中進行相關基因注釋，期望發現功能性變異位點，結合P<10-5，最終挑選了24個SNP位點進一步研究。

1.2.3 基因分型 采用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增DNA，Sequenom Massarray iPLEX系統(Sequenom, San Diego, CA)對篩選出的SNP位點進行基因型分型。

1.3 統計學方法 利用PLINK 1.07和SPSS 16.0軟件進行Hardy-Weinberg(HWE)平衡、最小等位基因頻率(MAF)、優勢比(Odds ratio，OR)、95%可信區間(Confidence intervals，CI)和P值分析，各組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基因分型 24個SNPs點中，rs76862907、rs77577614、rs78870722、rs75278634分型不符合Hardy-Weinberg 平衡(P-hwe<0.05)且P>0.05，故未做進一步分析，剩余20個SNPs均符合Hardy-Weinberg 平衡(P-hwe>0.05)，但SNP rs117222308得率(call rate)為0.042，故也未做進一步分析。SNP點rs2236313、rs9457258、rs720325、rs968334、rs3093025、rs55802221、rs1012656、rs6930998、rs1331299的等位基因頻率在病例組和對照組之間存在統計學差異，見表1。

表1 24個SNPs位點等位基因頻率的病例與對照比較

2.2 條件回歸分析結果 條件回歸分析結果(見表2)：控制SNP rs2236313后，只有rs720325、rs968334、rs9457258和rs3093025的P<0.05。但是分別控制rs720325、rs968334、rs9457258和rs3093025后，rs2236313的均P>0.05，故提示沒有獨立信號存在。

2.3 連鎖不平衡分析結果 在HapMap(CHB+JPT)數據庫中查詢5個陽性SNPs的r-square值。數據結果提示5個SNPs(rs2236313、rs9457258、rs720325、rs968334、rs3093025)間有中度連鎖關系，所有的D＇>0.7，r2> 0.4(圖1)。

圖1 5個陽性SNPs的LD Block示意圖

3 討論

白癜風是一種常見的皮膚色素脫失性疾病，多由后天獲得而來，其發病無明顯性別差異。白癜風的發病并不明確，但是其分子發病機制的研究是目前研究熱點。國內外學者利用全基因組關聯分析(GWAS)的方法對白癜風的易感基因進行了研究。本課題組前期利用GWAS的方法將白癜風易感基因定位在6q27區域的一個約200 kb的范圍內[3]， 但是并沒有發現白癜風的真正易感基因。為了進一步在中國漢族人群內將白癜風的易感位點6q27區域進行精細定位，本課題組通過基因型填補、連鎖不平衡分析和條件回歸分析等方法在2942例的白癜風患者和2850名健康對照者進行了深入研究。結果發現，在24個標簽SNPs點中，9個 SNPs位點的等位基因頻率在病例組和對照組具有統計學意義，但條件回歸分析并未發現新的獨立信號存在。連鎖不平衡分析發現rs2236313、rs9457258、rs720325、rs968334和rs3093025這5個陽性SNPs具有中度連鎖關系。本研究證實前期GWAS研究中發現的6q27區域內的rs2236313位點是中國漢族人群白癜風的常見變異的標簽SNP，結合Blood eQTL數據庫分析提示與6q27區域的關聯基因為RNA SET2基因。

RNA SET2基因系II類腫瘤抑制基因，其編碼分泌型糖蛋白RNA SET2，隸屬于核糖核酸酶Rh/T2/S家族，具有催化活性功能[4]。研究發現，RNA SET2參與腫瘤的形成，比如卵巢癌、黑素瘤，而且發現RNA SET2的表達量降低[5，6]。另外，也有研究發現RNA SET2能夠增強細胞氧化應激反應的敏感性，加速細胞凋亡[7]，從而可能參與白癜風的發病，因為氧化應激反應是白癜風的發病機制之一。

2010年，有學者在6q27區域內也發現了17個白癜風易感的SNPs位點，包括位于CCR6基因上游的rs6902119位點[8]。由于本課題組前期GWAS芯片數據不完全覆蓋歐洲人所報道的位點，故本研究通過基因型填補的方法發現了該位點與中國漢族人白癜風無明顯相關性，這說明本研究發現的標簽SNP與歐洲人群相比具有較大的遺傳異質性，這也為今后不同種族的白癜風發病風險預測、基因診斷以及藥物開發奠定了一定的基礎。

2013年有研究提示SNP rs2301436與小柳原田病(Vogt-Koyanagi-Harada，VKH)具有相關性，而白癜風也是VKH的一個臨床特征[9]。本研究通過條件回歸分析發現rs2301436與本研究所報道SNP rs2236313來自同一關聯信號，這強烈提示6q27區域內也可能存在與白癜風、VKH以及自身免疫均相關的易感基因。

在白癜風的發病中，遺傳及免疫機制在其發病中發揮重要作用[10]，其中，國內學者有研究發現中國尋常型白癜風與HLA-DRB1*070X、HLA-DRB1*1201和HLA-DQB1*0201具有明顯相關性[11，12]。本研究是在前期GWAS研究的基礎上對6q27區域進行精細定位研究，該區域與HLA所在的6q21區域尚有一定距離。雖然本研究沒有發現新的獨立信號存在，但是通過基因型填補及統計學分析再次證實了6q27區域內的rs2236313位點是中國漢族人群白癜風的常見變異的標簽SNP，根據基因型注釋以后的結果提示在中國漢族人群白癜風患者中與6q27區域的關聯基因為RNA SET2基因。接下來將會進一步對該基因進行變異的檢測和功能學研究，以期發現真正的易感基因，為進一步從分子遺傳學水平詳細闡明白癜風的發病機制，同時在為進行基因診斷、遺傳咨詢以及風險預測方面打下了堅實的基礎。

[1] Taieb A, Picardo M. Clinical practice. Vitiligo[J]. N Engl J Med,2009,360(2):160-169.

[2] 張學軍.皮膚性病學[M].8版.北京：人民衛生出版社，2013.185-187.

[3] Birlea SA, Gowan K, Fain PR, et al. Genome-Wide association study of generalized vitiligo in an isolated european founder population identifies SMOC2, in close proximity to IDDM8[J]. J Invest Dermatol,2009,130(3): 798-803.

[4] Campomenosi P, Salis S, Lindqvist C, et al. Characterization of RNA SET2, the first human member of the Rh/T2/S family of glycoproteins[J]. Arch Biochem Biophys,2006,449(1-2):17-26.

[5] Acquati F, Morelli C, Cinquetti R, et al. Cloning and characterization of a senescence inducing and class II tumor suppressor gene in ovarian carcinoma at chromosome region 6q27[J]. Oncogene,2001,20(8):980-988.

[6] Monti L, Rodolfo M, Lo Russo G, et al. RNA SET2 as a tumor antagonizing gene in a melanoma cancer model[J]. Oncol Res,2008,17(2):69-74.

[7] Thompson DM, Parker R. The RNA se Rny1p cleaves tRNAs and promotes cell death during oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae[J]. J Cell Biol,2009,185(1):43-50.

[8] Jin Y, Birlea SA, Fain PR, et al. Variant of TYR and autoimmunity susceptibility loci in generalized vitiligo[J]. N Engl J Med,2010,362(18):1686-1697.

[9] Yi X, Du L, Hou S, et al. FGFR1OP tagSNP but not CCR6 polymorphisms are associated with Vogt-Koyanagi-Harada syndrome in Chinese Han[J]. PloS One,2013,8(7):e69358.

[10] 楊珂,張學軍.白癜風免疫發病機制研究進展[J].中國麻風皮膚病雜志,2012,28(3):188-191.

[11] 王珺,孫曉杰,趙玉銘,等.白癜風125例臨床分析及與HLA-DQR1相關性研究[J].中國麻風皮膚病雜志,2009,25(12):888-889.

[12] 瞿鑌,徐愛娥,趙玉銘,等.白癜風243例臨床分析及與HLA-DQB1相關性研究[J].中華皮膚科雜志,2003,36(12):693-695.

(收稿：2016-12-27 修回：2017-02-17)

The fine mapping study for vitiligo susceptibility gene of 6q27 region in Chinese Han population

GAOMin,LIZenggang,ZHENGXiaodong,ZHOUFusheng,TANGXianfa.

DepartmentofDermatology,FirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022,China

Correspondingauthor:GAOMin,E-mail:ahhngm@163.com

Objective:To perform the fine mapping study for vitiligo susceptibility region 6q27 in order to identify the susceptibility gene in Chinese Han population. Methods: Total 24 tag SNPs were genotyped in 2942 patients with vitiligo and 2850 healthy controls. The PLINK 1.07 and SPSS19.0 software were used for statistical analysis, linkage disequilibrium and regression analysis. Results: (1) There were significant differences in the allele frequencies of rs2236313, rs9457258, rs720325, rs968334, rs3093025, rs55802221, rs1012656, rs6930998 and rs1331299 between the cases and controls. The regression analysis revealed that there was no independent signals in these SNPs. (2) The linkage disequilibrium analysis showed there was moderate linkage among rs2236313, rs9457258, rs720325, rs968334 and rs3093025 (D'>0.7，r2>0.4). Conclusion: This study identified the previous report, in which SNP rs2236313 is the tag SNP in the vitiligo patients of Chinese Han and the RNASET2 gene is an associated gene in 6q27 region.

vitiligo; susceptibility gene; fine mapping

國家自然科學基金資助(編號：81072460)

安徽醫科大學第一附屬醫院皮膚科，安徽合肥，230022

高敏，E-mail:ahhngm@163.com