銀杏葉提取物EGb761對氧化應激下白癜風黑素細胞抗氧化作用的影響

肖 茜 崔婷婷 高天文 王 琳

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銀杏葉提取物EGb761對氧化應激下白癜風黑素細胞抗氧化作用的影響

肖 茜 崔婷婷 高天文 王 琳

目的： 明確銀杏葉提取物(EGb761)對氧化應激下白癜風黑素細胞抗氧化作用的影響。方法： 人正常黑素細胞系PIG1予以H2O2處理建立氧化應激模型，予以不同濃度(50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL、400 μg/mL)EGb761處理，采用MTT法檢測PIG1細胞活力，生物化學方法檢測脂質過氧化代謝產物丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH),谷胱甘肽過氧化物酶活性及含量，流式細胞儀檢測細胞內活性氧(ROS)水平。結果： 與模型組比較，EGb761組PIG1細胞活力、SOD、GSH-Px水平增高，ROS、MDA及LDH的表達水平降低。結論： 銀杏葉提取物EGb761可保護黑素細胞抵抗氧化應激損傷。

銀杏葉提取物； 白癜風； 氧化應激

銀杏樹在我國分布非常廣泛，銀杏葉及銀杏果都具有良好的藥用價值，早在元代吳瑞著的《日用本草》中其藥用價值就有所記載。銀杏可以補氣養血，健脾益腎。自上世紀六十年代起，國外學者發現銀杏葉提取物(Extract of Ginkgo bilobaleaves，EGb761)具有較強的抗氧化作用，可以防治氧化應激引起的多種心腦血管疾病[1]。銀杏葉提取物中最主要的活性成分為銀杏總黃酮和銀杏內酯，具有抗炎，免疫調節及抗氧化等多種作用，它可以減輕氧化應激所致神經元損傷，促進受損神經功能恢復[2]，臨床應用于皮膚、心血管、神經、內分泌及免疫系統疾病的治療[3]。本研究擬采用銀杏葉提取物作用于H2O2誘導的黑素細胞氧化損傷，以觀察銀杏葉提取物對白癜風氧化應激的防治作用，從而為臨床白癜風的中藥防治提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 正常人黑素細胞系PIG1細胞，254培養基及人黑素細胞生長添加劑(美國Cascade Biologics/Invitrogen公司)，胎牛血清(美國GIBCO公司)，EGb761(德國Schwabe公司專利/臺灣濟生公司)，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液 (北京索萊寶科技有限公司)，二甲基亞砜(DMSO)，4,5-dimethylthiazol-2-基-2,5- diphe-nyltetrazolium溴化物(MTT)購自Sigma公司(密蘇里州，美國)。乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購自南京建成生物工程研究所(南京，中國)。超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)，丙二醛(MDA)試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 黑素細胞培養及EGb761最佳作用濃度及時間的篩選 取正常人黑素細胞系PIG1培養，采用含5%的胎牛血清、100 U/mL的青霉素及100 mg/mL鏈霉素的254培養基，于37℃、5% CO2孵育箱內培養。PIG1增殖至60%融合時加入0.5 mmol/L H2O2構建氧化應激模型組，分別于H2O2處理24 h后加入50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL、400 μg/mL的EGb761處理0、12、24、48 h。采用MTT法檢測黑素細胞的細胞活力變化。

1.2.2 MTT法檢測黑素細胞的活力 實驗分為三組，即空白組(未做任何處理)、模型組(0.5 mmol/L H2O2處理PIG1)及EGb761處理組(0.5 mmol/L H2O2處理24 h后加入100 μg/mL EGb761處理48 h)。各組細胞于96孔板培養，待檢測時每孔加入MTT檢測液 20 μL，將其置于37 ℃、5%的CO2孵育箱中培養4 h；然后再加入DMSO 150 μL并將其置于搖床上10 min，用波長為570 nm的酶標儀測定黑素細胞活力的變化。

1.2.3 細胞內活性氧(ROS)水平的測定 細胞處理同理同上，待檢測時收集細胞，加入終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA，置于37 ℃中作用45 min，然后于流式細胞儀488 nm處檢測細胞內DCF平均熒光強度(%)。

1.2.4 酶學、生物化學方法檢測氧化應激相關產物檢測 細胞處理同理同上，按照試劑盒說明檢測各組細胞中丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性及含量，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行分析，數據以均數±標準差表示。兩組數據比較分析，定性資料采用Wilcoxon秩和檢驗或者卡方檢驗。定量資料符合正態分布的數據采用單因素方差分析方法，方差不齊時選用Satterthwaite方法進行校正的t檢驗，不符合正態分布的數據采用Wilcoxon秩和檢驗。實驗結果以P<0.05為差異有顯著性統計學意義。

2 結果

2.1 EGb761對氧化應激下PIG1細胞活力的影響 MTT檢測結果顯示，加入不同濃度的EGb761后，黑素細胞的活力可以不同程度的升高，且隨著時間的延長細胞活力增加，我們研究發現100 μg/mL的EGb761處理PIG1 48 h時，細胞活力最高(圖1)，因此我們后續試驗選用100 μg/mL為EGb761的最佳作用濃度，并選定處理48 h為作用時間進行研究。

圖1 EGb761對氧化應激下黑素細胞活力的影響(n=10)

2.2 EGb761對氧化應激下PIG1細胞抗氧化能力的影響 MTT檢測結果顯示，100 μg/mL EGb761可以顯著增加H2O2處理下PIG1細胞的活力(圖2a)，并且加入EGb761后LDH的釋放由13.5%降低到9.4%，顯著降低H2O2處理誘導的乳酸脫氫酶(LDH)的釋放(圖2b)；并且EGb761可顯著降低細胞內ROS水平(圖3a)；對脂質過氧化代謝產物丙二醛(MDA)的含量檢測，發現空白組為(8.8±0.5)μmol/mg蛋白，加入H2O2后上升為(22.3±1.5)μmol/mg蛋白，而加入EGb761處理后降低至(17.8±0.7)μmol/mg蛋白(圖3)；接下來，我們檢測了細胞內抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性，發現H2O2處理黑素細胞后，SOD活性由(2.87±0.26)Unit/mg蛋白下調至(1.38±0.2)Unit/mg蛋白，而EGb761處理后可回升至(2.74±0.34)Unit/mg蛋白(圖4a)；同樣加入EGb761后GSH-Px的活性由模型組的(16.9±0.9)Unit/mg蛋白上升至(24.2±1.8)Unit/mg蛋白(圖4b)，表明EGb761可以誘導氧化應激下黑素細胞SOD及GSH-Px活性增強。綜合以上結果，表明EGb761可以不同程度的改善黑素細胞的氧化損傷修復，對黑素細胞氧化應激損傷具有保護作用。

圖2 a：EGb761對氧化應激下黑素細胞活力影響(n=10，##P<0.01 vs空白組；**P<0.01 vs 模型組)；b：EGb761對氧化應激下黑素細胞LDH釋放的影響(n=10，##P<0.01 vs 空白組；**P< 0.01 vs模型組)

圖3 a：EGb761對氧化應激下黑素細胞細胞內ROS(n=10，##P< 0.051 vs 空白組；**P< 0.01 vs 模型組)；b：EGb761對氧化應激下黑素細胞MDA生成的影響(n=10，##P< 0.051 vs 空白組；**P< 0.01 vs 模型組)

圖4 a：EGb761對氧化應激下黑素細胞抗氧化酶SOD活性的影響(n=10，##P<0.01 vs 空白組；**P<0.01 vs 模型組)；b：EGb761對氧化應激下黑素細胞GSH-Px活性的影響(n=10，##P<0.01 vs 空白組；**P<0.01 vs 模型組)

3 討論

白癜風是一種由于色素脫失所致的皮膚病。《諸病源候論》中記載：“面及頸身體皮肉色變白，與肉色不同，亦不癢痛，謂之白癜”。白癜風雖易于診斷卻難于治療，影響容貌，給患者帶來極大的心理影響和生活壓力。本研究期望對白癜風的預防、治療與調養起到指導作用提供實驗依據。

黑素細胞起源于外胚層的神經嵴, 在胚胎發育過程中通過間充質逐漸移行到表皮、毛囊、眼等處。黑素細胞的發育大致經歷了神經嵴細胞、成黑素細胞和黑素細胞三個階段。黑素細胞的數量或功能異常, 將會引起許多色素性皮膚病, 如白癜風或黃褐斑等。在研究白癜風氧化應激的實驗中，研究者多把不同濃度的中藥加入到H2O2處理的黑素細胞培養中，觀察中藥在體外對白癜風黑素細胞氧化應激損傷所起的干預作用。

銀杏葉提取物是一種廣泛應用的天然藥物。目前國際上公認的標準銀杏葉提取物是按德國Schwabe專利工藝生產的EGb761，它是從銀杏葉中經多個步驟分離、純化而提取出的一種標準化的銀杏葉提取物制劑，其中包含24%銀杏黃酮苷類和6%銀杏萜內酯類成分。Scholtyssek等[4]證實銀杏葉提取物中的銀杏糖苷B、C、J和M及銀杏內酯具有抗氧化的功能。Parsad等[5]將銀杏葉提取物用于治療局限型，進展緩慢的白癜風，研究結果顯示：治療組患者白斑區的擴展較安慰劑組明顯減慢，甚至停止。并且25例患者中有10例患者經銀杏葉提取液治療后，取得了顯著復色(>75%)或者完全復色。

我們前期實驗研究表明[2]，EGb761可以減輕β淀粉樣蛋白所致的海馬神經元氧化應激損傷，改善神經再生微環境，促進受損神經細胞生長，從而對神經細胞發揮著較強的抗氧化作用。既然黑素細胞起源于神經細胞，且海馬神經元也起源于神經細胞，EGb761對海馬神經元有保護作用，那么，EGb761能否對黑素細胞氧化應激損傷也起到保護作用呢？國外有學者[6]在臨床上應用EGb761治療白癜風獲得了一定的臨床療效，但EGb761治療白癜風的具體作用機制尚不清楚，目前國內外在EGb761對黑素細胞氧化應激損傷的生物學功能研究方面尚未見報道。我們通過以上研究，發現EGb761可以一定程度的提高黑素細胞的存活率，實驗結果表明EGb761可以改善氧化應激相關指標的變化，對抗黑素細胞氧化應激損傷，初步確定了銀杏葉提取物對白癜風黑素細胞氧化應激損傷具有保護作用，可以防治氧化應激引起的白癜風等黑素細胞相關疾病，從而為白癜風的藥物防治提供新的實驗依據及研究思路。

[1] Le Bars PL, Velasco FM, Ferguson JM, et al. Influence of the severity of cognitive impairment on the effect of the Ginkgo biloba extract EGb761 in Alzheimer's disease[J]. Neuropsychobiology,2002,45(1):19-26.

[2] Xiao Q, Wang C, Li J, et al. Ginkgolide B protects hippocampal neurons from apoptosis induced by beta-amyloid 25-35 partly via up-regulation of brain-derived neurotrophic factor[J]. European Journal of Pharmacology,2010,12(647):48-54.

[3] 王濤，許愛娥.銀杏葉提取物EGb761神經保護作用研究進展[J].國際皮膚性病學雜志，2010，36(2)：101-103.

[4] Scholtyssek H, Damerau W, Wessel R, et al. Antioxidative activity of ginkgolides against superoxide in an aprotic environment[J]. Chem Biol Interact,1997,106(3):183-190.

[5] Parsad D, Pandhi R, Juneja A. Effectiveness of oral Ginkgo biloba in treating limited, slowly spreading vitiligo[J]. Clin Exp Dermatol,2003,28 (3):285-287.

[6] Szczurko O, Shear N, Taddio A, et al. Ginkgo biloba for the treatment of vitilgo vulgaris: an open label pilot clinical trial[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine,2011,11(21):1472-1481.

(收稿：2016-09-07 修回：2016-09-27)

Effects of ginkgo biloba extract EGb761 on anti-oxidation of melanocytes under oxidative stress in vitiligo

XIAOQian,CUITingting,GAOTianwen,WANGLin.

DepartmentofDermatology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032,China

Correspondingauthor:WANGLin,E-mail:wanglin@fmmu.edu.cn

Objective: To determine the effect of ginkgo biloba extract (EGb761) on the anti-oxidation of melanocytes under oxidative stress in vitiligo. Methods: The normal human melanocyte cell line PIG1 was treated with H2O2firstly, followed by different concentrations (50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL, 300 μg/mL, 400 μg/mL) of EGb761. The cell viability was measured by MTT. The levels of lipid peroxide metabolites such as malondialdehyde (MDA), lactic dehydrogenase (LDH) and GSH-Px were measured by biochemical methods. The level of cellular reactive oxygen species (ROS) was detected by flow cytometry. Results: Compared with control group, the expression levels of PIGI cell viability, SOD and GSH-Px were increased, and the expression levels of ROS, MDA and LDH were decreased in EGb761 group. Conclusion: EGb761 has a potential role in protecting melanocytes against H2O2-induced oxidative stress.

ginkgo biloba extract; vitiligo; oxidative stress

第四軍醫大學西京皮膚醫院，陜西西安，710032

王琳，E-mail: wanglin@fmmu.edu.cn