Notch1對肺纖維化小鼠腸黏膜屏障的影響及作用機制研究

郭 慧，劉學(xué)軍，杜毓鋒，郝小燕，張 帆，郭娜娜，林白陽

Notch1對肺纖維化小鼠腸黏膜屏障的影響及作用機制研究

郭 慧，劉學(xué)軍，杜毓鋒，郝小燕，張 帆，郭娜娜，林白陽

目的 探討Notch1在肺纖維化腸黏膜屏障中的影響及其作用機制。方法 將24只健康雄性C57BL/6小鼠隨機分為正常對照組(N組)、肺纖維化模型組(I組)、肺纖維化+Notch1抑制組(I+D組)。I組、I+D組氣管內(nèi)注入博來霉素造模，I+D組在造模后1周開始腹腔注射Notch1抑制劑DAPT。在造模后28 d全部處死小鼠，取小鼠血液、肺臟、回腸末端10 cm。血液離心后的血清用于ELISA測量丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的含量。右肺、5 cm回腸石蠟包埋后采用HE、Masson染色，并測量腸黏膜、腸絨毛以及腸隱窩的高度。PCR測量左肺、5 cm回腸末端的Notch1mRNA含量。結(jié)果 小鼠肺部HE染色、Masson染色、Ashcroft評分提示I組存在明顯的纖維化改變，與N組、I+D組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。I組小鼠腸黏膜厚度、絨毛高度、血清中T-SOD、GSH-PX含量明顯低于N組、I+D組，腸道Chiu’s分級、血清MDA的含量明顯高于N組、I+D組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明IPF小鼠腸黏膜上皮細胞完整性被破壞、黏膜損傷。小鼠腸隱窩深度的測量結(jié)果提示I組腸隱窩細胞增生明顯高于N組、I+D組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。I組肺組織、腸道組織中Notch1 mRNA的表達高于N組、I+D組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 Notch1表達增高促進了肺纖維化的發(fā)生，小鼠肺纖維化體內(nèi)存在腸黏膜的損傷、壞死脫落，Notch1同時可以通過腸上皮隱窩增生介導(dǎo)腸上皮損傷后修復(fù)。

肺纖維化；腸黏膜屏障；Notch1；丙二醛；總超氧化物歧化酶；谷胱甘肽過氧化物酶

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種慢性、進行性和致死性惡性間質(zhì)性肺疾病[1]。一旦確診，平均生存期3年～5年，且病死率逐年上升，目前病因尚未完全闡明。IPF典型的臨床癥狀是逐漸加重的呼吸困難、低氧血癥，而腸黏膜對缺氧十分敏感。Notch1在肺、腸的發(fā)育中呈動態(tài)表達，并在調(diào)控其細胞的分化、增殖、凋亡中起關(guān)鍵作用[2-3]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物以及分組 24只雄性C57BL/6小鼠，SPF級，體重20 g～25 g。將小鼠按照隨機數(shù)字表獲得的編號按大小分為3組，每組8只。

1.2 要試劑及儀器 博來霉素(15 mg，日本株式會社)；DAPT(美國selleckchem公司)；Masson染色試劑盒(北京索萊寶)；丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒(南京建成)；引物合成(上海生工)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA，大連寶生物)；擴增試劑盒(Vazyme，諾唯贊)。實驗中所用的Scanscope數(shù)字病理掃描系統(tǒng)、基因擴增儀、熒光定量PCR儀由山西醫(yī)科大學(xué)科研中心提供。

1.3 方法

1.3.1 造模及取材 I組及I+D組按5 mg/kg氣管內(nèi)注入博來霉素。造模1周后，每天將DAPT腹腔注入I+D組，共7 d。造模后28 d后，所有小鼠均處死取材。心臟取血，收集入紫管。離心后，將血清標(biāo)記，儲存于-80 ℃冰箱。取小鼠左肺、右肺、回盲部上端10 cm腸道組織。左肺、5 cm回腸標(biāo)記后儲存于-80 ℃冰箱，右肺、5 cm回腸于10%甲醛液中固定，石蠟包埋。

1.3.2 HE、Masson染色 肺臟、腸道的石蠟組織包埋后切片，按標(biāo)準(zhǔn)步驟進行HE染色。Masson染色測定肺部纖維化的程度，按其說明書進行操作。

1.3.3 病理性分析 肺纖維化程度采用Ashcroft評分，共8級。腸黏膜損傷以Chiu’s分級為評分標(biāo)準(zhǔn)，共6級。請兩名病理學(xué)工作人員盲評，以評分的均數(shù)作為最后得分。

1.3.4 小腸黏膜形態(tài)學(xué)指標(biāo) 采用Scanscope數(shù)字病理掃描系統(tǒng)測定回腸黏膜、絨毛以及隱窩高度，每個標(biāo)本測定5個完整黏膜、絨毛以及隱窩高度，取其平均值。

1.3.5 血清MDA、T-SOD、GSH-PX測定 MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，腸黏膜細胞受損、壞死后，可釋放入血，是反映腸黏膜上皮細胞完整性和損傷程度的可靠的生化指標(biāo)[4-5]。T-SOD、GSH-PX是體內(nèi)清除氧自由基的重要酶，其減少可間接反映腸黏膜的損傷。

1.3.6 PCR測定血清、肺組織、腸道組織Notch1的表達量 采用酚氯仿的方法提取RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒在基因擴增儀生成c-DNA，利用擴增試劑盒在熒光定量PCR儀進行擴增，得到CT值，利用2-ΔΔCT計算Notch1在各組間的相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠的一般情況 N組造模后一般情況好，與造模前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。造模后I組小鼠毛發(fā)灰暗，食欲下降，活動少，呼吸淺快，偶可聞及喘息。I+D組情況較I組稍好。

2.2 肺組織HE染色、Masson染色，腸道HE染色 N組肺泡結(jié)構(gòu)基本完整，肺泡壁未增厚。I組大量肺泡結(jié)構(gòu)破壞，部分肺泡塌陷融合，肺泡間隔增厚，出現(xiàn)大量寬帶狀及片狀膠原纖維，呈彌漫纖維化改變。I+D組改變較I組輕。提示I組、I+D造模成功，DAPT抑制Notch1減輕肺纖維化。詳見圖 1、圖2。

N組 I組 I+D組

N組 I組 I+D組

N組腸黏膜連續(xù)、完好，I組大量腸絨毛及固有膜脫落，同時存在隱窩增生，I+D組改變較I組輕。提示IPF小鼠存在腸黏膜損傷，且損傷后通過隱窩增生以替代壞死的腸絨毛。詳見圖3。

N組 I組 I+D組

2.3 肺部、腸道的病理學(xué)分析 I組肺纖維化ashcroft評分為(6.88±0.24)分，提示存在明顯的肺纖維化，伴有肺組織結(jié)構(gòu)的破壞，存在纖維條帶或纖維小結(jié)的形成。I組腸黏膜損傷Chiu’s分級為(3.88±0.19)分，提示大片腸黏膜上皮抬高，絨毛向兩側(cè)倒伏，部分絨毛頂端脫落。I組ashcroft評分、Chiu’s分級較N組、I+D組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。詳見表1。

表1 各組ashcroft評分、Chiu’s分級比較(±s) 分

2.4 小腸黏膜形態(tài)學(xué)指標(biāo) I組腸黏膜厚度較N組明顯降低，較I+D組輕微減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。I組腸絨毛高度較N組、I+D組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果提示IPF小鼠體內(nèi)存在腸黏膜的損傷、壞死脫落。I+D組小鼠可能通過抑制Notch1表達減輕肺纖維化程度，腸黏膜缺氧較輕，從而腸黏膜損傷較I組輕。I組隱窩深度較N組、I+D組深，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。I+D組隱窩細胞深度的顯著降低，提示Notch1在IPF小鼠腸隱窩的增生以修復(fù)腸黏膜的損傷中起到重要作用。詳見表2。

表2 各組腸黏膜厚度、絨毛高度、隱窩深度比較(±s) μm

2.5 血清MDA、T-SOD、GSH-PX測定結(jié)果 I組MDA含量較N組、I+D組高，T-SOD、GSH-PX含量較N組、I+D組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。提示I組、I+D組存在腸黏膜損傷，I+D組較I組輕。詳見表3。

表3 各組血清MDA、T-SOD、GSH-PX比較(±s)

2.6 小鼠肺、腸道中Notch1mRNA的相對表達量 各組小鼠肺臟、腸道組織的Notch1mRNA表達呈現(xiàn)一致性。I組Notch1的表達較N組、I+D組升高。提示Notch1表達增高促進了IPF的發(fā)生，DAPT通過抑制Notch1的表達發(fā)揮抗纖維化作用。同時，Notch1在IPF小鼠腸道表達增高，可能介導(dǎo)了IPF腸黏膜損傷后的修復(fù)，DAPT也可以抑制腸隱窩細胞增生。詳見表4。

表4 各組小鼠肺、腸道中Notch1mRNA的相對表達量(±s)

3 討 論

Notch1是Notch信號通路的受體蛋白。Notch信號通路與肺部許多常見疾病的發(fā)生相關(guān)聯(lián)，例如哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺動脈高壓、肺癌。同時，Notch通路的激活介導(dǎo)肺纖維化的發(fā)生。 Aoyagi- Ikeda等[6]研究表明 Notch1通過 TGF-β1- smad3通路誘導(dǎo)肺泡上皮細胞分化形成肌成纖維細胞(EMT)，而 EMT是肺纖維發(fā)生的一個主要環(huán)節(jié)。本實驗通過博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化，并通過DAPT抑制Notch1的表達，證實了Notch信號通路在IPF的發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

腸道的機械屏障由腸道黏膜上皮細胞、細胞間緊密連接等構(gòu)成，能阻擋腸內(nèi)有害物質(zhì)如細菌及內(nèi)毒素穿透腸黏膜進入深部組織。肺部疾病的發(fā)生通常伴有腸道形態(tài)及功能的改變。Du等[7]研究認為金葡萄球菌肺炎發(fā)生時，存在腸道黏膜損傷、腸上皮細胞的凋亡。Li等[8]通過大鼠暴露于香煙煙霧誘導(dǎo)COPD模型中，大鼠全身存在氧化應(yīng)激和炎癥，通過線粒體凋亡途徑增加腸上皮細胞死亡。同時腸道的氧化應(yīng)激促進了缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)的活化，從而破壞了腸上皮的緊密連接，增加了腸上皮的滲透性。本實驗通過測量腸黏膜厚度、絨毛長度，Chiu’s評分，血清中MDA、T-SOD、GSH-PX測定，證實了肺纖維化小鼠存在腸黏膜損傷。其機制可能與肺纖維化導(dǎo)致全身慢性缺氧有關(guān)。小腸絨毛的解剖結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其氧分壓遠低于動脈血，對缺氧十分敏感。腸絨毛缺氧時因代謝障礙導(dǎo)致細胞間連接斷裂、細胞水腫甚至壞死。同時缺氧可激活多種炎癥介質(zhì)，加劇了腸上皮的毀傷。

Notch信號通路在維持腸上皮穩(wěn)態(tài)發(fā)揮關(guān)鍵作用。腸上皮是身體中更新最快的組織，其分裂和遷移的干細胞數(shù)量主要是隱窩底部細胞，LGR5是腸活性干細胞群體的特異性標(biāo)記物[9]。Chen等[10]研究提示腸隱窩細胞通過結(jié)合Notch1基因的第二個內(nèi)含子采用正反饋介導(dǎo)腸上皮的再生和干細胞的自我更新。Carulli等[11]研究提示在Notch1缺陷小鼠的在輻射損傷后隱窩增生受損。本實驗通過測量隱窩的深度、PCR證實了Notch1介導(dǎo)了肺纖維化小鼠腸黏膜損傷后的修復(fù)。

肺纖維化腸黏膜的改變可能涉及許多信號分子，其組成了一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，本實驗提示Notch1介導(dǎo)腸損傷后的修復(fù)。本實驗著重探索腸黏膜機械屏障的改變，肺纖維化的腸黏膜可能存在免疫屏障中IgA分子、生物屏障中菌群的移位等眾多改變，其中的機制需要更進一步的研究。

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(本文編輯郭懷印)

山西省自然科學(xué)基金面上項目(No.201601D011105)

山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院(太原 030001)

劉學(xué)軍，E-mail：lxj20041205@sina.com

信息：郭慧，劉學(xué)軍，杜毓鋒，等.Notch1對肺纖維化小鼠腸黏膜屏障的影響及作用機制研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(13)：1572-1575.

R563 R259

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.13.009

1672-1349(2017)13-1572-04

2017-02-18)