基于RSM模型對纖維素酶預處理制備MFC的參數優化

張啟蓮 張正健 陳蘊智 李志紅

(天津科技大學包裝與印刷工程學院，中國輕工業食品包裝材料與技術重點實驗室，天津，300222)

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·MFC制備·

基于RSM模型對纖維素酶預處理制備MFC的參數優化

張啟蓮 張正健*陳蘊智 李志紅

(天津科技大學包裝與印刷工程學院，中國輕工業食品包裝材料與技術重點實驗室，天津，300222)

研究了響應曲面法(RSM)應用于纖維素酶預處理制備微纖化纖維素(MFC)的工藝條件優化，首先通過馬爾文粒度儀、剛果紅染色法等手段對MFC性能進行單因素分析，然后以MFC的粒徑、比表面積為響應值，采用RSM對工藝條件進行優化和分析。結果表明，紙漿濃度、酶用量、酶處理時間的變化對于制備的MFC性能都具有一定的影響，依據單因素分析，利用RSM進行參數優化，預測得出酶預處理制備MFC的優化條件為：紙漿濃度為10%，酶用量為10.53 U/g，處理時間為24 h。

微纖化纖維素；響應曲面法；粒徑；比表面積；參數優化

微纖化纖維素(microfibrillated cellulose，簡稱MFC)是一種新型纖維素產品，其最初是在20世紀80年代由Herrick等人[1]和Turback等人[2]首先開發出的。MFC是一種通過機械力對纖維素進行反復并且高強度的均質化處理后得到的纖維產品，呈高潤脹膠體狀，一般情況MFC的直徑為20～60 nm，長度大約為幾微米到十幾微米，長徑比在100～150范圍內[3]。制備出的MFC具有許多優異的性能，如較強的化學反應活性、高強度、較大比表面積和低熱膨脹系數等，被廣泛用于聚合物、生物材料、涂料、食品、化妝品、醫療、包裝和印刷等領域[4-7]。特別是，與普通纖維素相比，MFC的抗張強度和楊氏模量很大，因此其可以形成網狀結構，也能與其他材料很好地共混成型，為新型材料的制備及其應用提供了更加廣泛的選擇。

在MFC的制備過程中，若不采用任何預處理，單純通過機械處理，存在能耗高(20～40 kWh/kg)、效率低、性能不穩定、難以工業化生產等缺點[8]，所以需要結合預處理技術來制備MFC。在國內外現有的預處理技術中，相對于酸處理、堿處理、羧甲基化處理和TEMPO催化氧化預處理等處理方法[9-13]，酶預處理法[14-15]制備MFC具有很多其他方法都不具有的優勢，如反應條件溫和、能耗低、經濟環保等，并且預處理所使用的酶本身也是一種可再生資源，因此酶預處理將會越來越多地應用于MFC的制備中。

響應曲面法(RSM)優化是一種實驗條件優化的方法，將實驗得出的數據結果進行響應面分析，通過多項式模型擬合得到預測模型，在各因素水平響應值的基礎上，找出預測的響應最優值以及相應的實驗條件。作為一種普遍適用的實驗設計、分析工具，RSM應用于MFC的制備體現了突出的優勢和作用，適用于一些因所用酶的品質、加工設備的特性、MFC應用的方向、成本要求等因素的變化而有所影響的情況。目前該方法已經廣泛應用于科研領域的建模分析優化，但在酶預處理制備MFC的最優化研究方面鮮有報道。本研究以MFC的粒徑、比表面積作為評價指標，考察紙漿濃度、酶用量和酶處理時間對MFC性能的影響，通過以響應曲面優化法(RSM)為依據的Box-Behnken實驗，建立多項式預測模型并分析其有效性，進而得到最優工藝參數，為MFC的制備及條件優化提供參考和依據。

1 實 驗

1.1 實驗材料

漂白硫酸鹽桉木漿，芬歐匯川紙業有限公司；蘇柯漢纖維素酶，山東濰坊蘇柯漢生物公司；剛果紅，北京諾博萊德科技有限公司。

1.2 實驗儀器

瓦利打漿機(T2505，上海首力貿易有限公司)；打漿度測定儀(ZDJ-100，四川宜賓造紙廠)；PFI磨(P40110.E00，上海久久貿易有限公司)；高壓均質機(GJJ，上海臺馳輕工裝備有限公司)；馬爾文粒度儀(Mastersizer3000E，德國馬爾文公司)；紫外分光光度計(UV-2700，上海天河環境技術有限公司)。

圖1 MFC的制備路線

1.3 實驗方法

纖維素酶預處理制備MFC：經蒸餾水清洗干凈的漂白硫酸鹽桉木漿先經過瓦利打漿機處理、纖維素酶預處理、PFI磨的機械處理，最后將處理后的漿料進行連續高壓均質處理最終制得所需產品，制備過程如圖1所示。在整個生產過程中，纖維素酶預處理起著關鍵作用[16-17]。

單因素實驗：通過控制紙漿濃度、酶用量和酶處理時間在預處理制備MFC過程中的改變量，考察單一因素對MFC性能的影響。

RSM條件優化：以MFC的粒徑、比表面積為響應值，采用RSM分析法進行工藝條件及交互作用的數據優化和分析，得出最適的工藝條件。本研究根據Box-Behnken實驗設計原理，在單因素實驗的基礎上，采用三因素三水平的RSM，以酶用量、酶處理時間和紙漿濃度為自變量因素，分別以A、B、C來表示，并以+1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平，進行編碼，如表1所示。

表1 實驗自變量因素水平及編碼

2 結果與分析

2.1 MFC性能的單因素分析

在纖維素酶預處理實驗中，紙漿濃度和酶用量以及酶處理時間是決定酶處理效果的關鍵因素。紙漿濃度影響酶與纖維素反應體系的反應速率，反應速率會隨紙漿濃度的增加而增加，但過高的紙漿濃度也會抑制反應速率[18]；酶用量可以直接反映體系中酶的濃度，酶用量過低不能有效水解纖維素纖維，酶用量過高又會導致纖維素纖維水解過度，因此酶用量也直接與生產成本相關；酶處理時間的長短對纖維素纖維的水解作用影響也很大，如果酶處理時間過長，一方面酶的活性會有所下降，另一方面也影響制備的MFC的性能。因此，有必要探討紙漿濃度和酶用量以及酶處理時間對酶預處理制備的MFC性能的影響。

2.1.1 預處理紙漿濃度對MFC性能的影響

圖2 不同紙漿濃度制備MFC的粒徑和比表面積的變化

圖2為不同紙漿濃度制備MFC的粒徑和比表面積的變化。從圖2中可以看出，隨著紙漿濃度從2%增加到10%，MFC的粒徑從52.4 μm減小到40.8 μm，比表面積從30.08 m2/g增至35.05 m2/g。這表明紙漿濃度對MFC粒度具有相當大的影響，主要是由于預處理漿濃增加，提高了單位體積的纖維素酶含量，從而提升了纖維素酶的預處理效率，有利于纖維細胞壁的潤脹和細纖維化以及后續高壓均質，使得MFC的粒徑減小、比表面積增大。

2.1.2 預處理纖維素酶用量對MFC性能的影響

圖3表示的是不同用量纖維素酶制備MFC的粒徑和比表面積的變化。從圖3中可以看出，隨著酶用量的增加，MFC的粒徑先減小后增加，并且在酶用量為10 U/g時粒徑達到最小；而MFC的比表面積先增加后減小，并且在酶用量為10 U/g時所制備的MFC比表面積最大。這主要是由于酶用量增加時會增加酶蛋白與纖維的結合位點，相應的增加纖維素酶水解纖維素纖維的反應速率；當酶用量增加到一定程度時，纖維與酶的結合位點就會達到飽和，纖維素酶水解纖維素纖維的反應速率達到最大，如果繼續增加酶用量，這時反應速率可能會因為產物抑制而不能得到增加，從而導致制備的MFC的粒徑增大，比表面積有所下降。

圖3 不同用量纖維素酶制備MFC的粒徑和比表面積的變化

2.1.3 纖維素酶處理時間對MFC性能的影響

圖4 纖維素酶不同處理時間制備MFC的粒徑和比表面積的變化

圖4表示的是纖維素酶不同處理時間制備MFC的粒徑和比表面積的變化。由圖4可以看出，隨著酶處理時間的增加，MFC的粒徑呈先減小后增大的趨勢，在酶處理時間為16 h時MFC的粒徑最小。這是由于酶處理時間過長導致纖維素纖維過度水解，從而使MFC的粒徑反而越來越大。從圖4中還可以看出，在纖維素酶不同處理時間下，制備的MFC的比表面積隨著酶處理時間的增加呈現先增大后減小的趨勢，在酶處理時間為16 h時MFC的比表面積最大。這是由于酶對纖維素纖維的水解速度會隨著時間的增加而增加，從而達到平衡，但是隨著酶處理時間繼續增加，產物不斷增多則會對反應產生抑制作用，使反應速率越來越慢，并且導致纖維素纖維過度水解，從而使MFC的比表面積反而越來越小。

2.2 RSM優化纖維素酶處理制備MFC

2.2.1 RSM實驗結果及模型確定

依據單因素實驗所得數據，設計紙漿濃度、酶用量、酶處理時間三因素三水平實驗(見表1)，基于響應曲面軟件設計17組實驗，各組實驗條件及結果見表2。

利用Design-Expert軟件對制備的MFC粒徑和比表面積與不同操作變量之間關系進行多種擬合，對擬合模型的方差分析比較。對表3、表4、表5、表6關于粒徑和比表面積的數據進行方差分析，其中，表5和表6是MFC粒徑和比表面積的4種回歸模型的方差分析。首先，由表3、表4的F值和P值可以看出，兩組實驗數據的線性擬合和三次模型擬合都不顯著，而二次模型擬合比較顯著，所以二次多項式模型在本實驗中可信度比較強。然后，對于4種模型的R2和R2校正值進行分析，通過表5和表6可以發現，無論對于比表面積或者粒徑來說，它們的二次、三次模型的R2和R2校正值基本相同，并且都明顯比線性模型和雙因素模型好，同時可以看出二次模型R2預測值是最大的，且預測殘差平方是最小的，一般系統趨向于選擇擁有最大預測值和最小預測殘差平方的模型，即二次多項式模型。綜上所述，采用二次多項式模型更加符合實驗的要求。

表2 各組實驗條件和結果

表3 粒徑的多種模型方差分析比較

表4 比表面積的多種模型方差分析比較

表5 粒徑的R2綜合分析

表6 比表面積的R2綜合分析

圖5為粒徑和比表面積的預測值與實際值的對比圖。從圖5可以看出，實際值比較均勻地分布在預測曲線旁邊，說明本實驗的回歸模型的可信性良好。表7和表8分別為粒徑和比表面積的回歸模型方差分析表。由表7和表8可以看出，粒徑模型和比表面積模型的F值為分別為39.71和24.70，P值為<0.0001,遠遠小于檢驗規定的一般顯著性(0.05和0.01)，失擬項P值分別為0.0520與0.0600，均大于0.05，二次多項式模型具有很好的顯著性而且失擬項不顯著，因此這兩個模型的擬合程度比較好，實驗誤差也比較小，因此可以用這兩個模型分別對MFC粒徑和比表面積進行預測。從表5和表6中可以看出，粒徑模型的預測值與實際值之間的相關性達為98.08%，R2校正值為0.9561，表明MFC制備工藝中，此模型能夠解釋95.61%響應值的變化；比表面積模型的預測值與實際值之間的相關性達為96.95%，R2校正值為0.9302，表明MFC制備工藝中，此模型能夠解釋93.02%響應值的變化，因此說明這兩個模型的擬合程度良好。

圖5 預測值與實際值的對比

從表7的P值來分析，其中A、AB、A2、C2達到極顯著水平(P<0.01)，B2達到顯著水平(P<0.05)，表明酶用量獨自或兩兩交互都在MFC粒徑大小中起到比較顯著的作用效果，而紙漿濃度以及酶處理時間作用卻不明顯。從表8的P值分析，其中A、AB、BC、A2、B2達到極顯著水平(P<0.01)，C達到顯著水平(P<0.05)，表明酶用量獨自或兩兩交互都在MFC比表面積大小中起到比較顯著的作用效果，而紙漿濃度以及處理時間作用一般。

表7 粒徑的回歸模型方差分析表

表8 比表面積的回歸模型方差分析表

綜合考慮3個因素的二次及交互作用的影響，在實驗考察范圍內，3個因素對MFC粒徑和比表面積影響的主次順序為：酶用量>酶處理時間>紙漿濃度。

2.2.2 模型的響應面交互作用分析

(1)酶用量與酶處理時間的交互影響分析

圖6為酶用量與酶處理時間的等高圖和響應曲面。圖6(a)和圖6(b)的左圖分別表示在紙漿濃度為8%(0水平)時，酶用量和酶處理時間的等高線，該圖反映酶用量和酶處理時間因素以及兩者的交互作用對MFC粒徑和比表面積的影響。由圖6(a)和圖6(b)的右圖可以看出，酶用量是MFC粒徑的顯著影響因素，而酶處理時間在此區間內對MFC粒徑與比表面積的影響并不明顯。而從表7可以看出AB交叉作用的P值<0.0001，所以酶用量和酶處理時間的交互作用較強。紙漿濃度一定，隨著酶用量的增加，MFC的粒徑顯著增大，比表面積變小。當酶用量為10 U/g左右時，MFC粒徑最小，比表面積最大。

(2)酶用量與紙漿濃度的交互影響分析

圖7為酶用量與紙漿濃度的等高圖和響應曲面。圖7(a)和圖7(b)的左圖表示在酶處理時間為20 h(0水平)時，酶用量和紙漿濃度的等高線，該圖反映酶用量和紙漿濃度因素以及兩者的交互作用對MFC粒徑和比表面積的影響。從圖7(a)和圖7(b)的右圖可以看出，酶用量是MFC粒徑和比表面積的顯著影響因素，而紙漿濃度在此區間內對MFC粒徑和比表面積的影響并不明顯，而從表8可以看出AC交叉作用的P值比較大，所以酶用量和紙漿濃度的交互作用較弱。酶處理時間一定，隨著漿濃的增加，MFC的粒徑變化比較小，比表面積較大。當漿濃為10%左右時，MFC粒徑相對較小，而比表面積相對較大。

(3)酶處理時間與紙漿濃度的交互影響分析

圖8為酶處理時間與紙漿濃度的等高圖和響應曲面。圖8(a)和圖8(b)的左圖表示在酶用量為20 U/g(0水平)時，酶處理時間和紙漿濃度的等高線，該圖反映酶處理時間和紙漿濃度因素以及兩者的交互作用對MFC粒徑和比表面積的影響。由圖8(a)和圖8(b)的右圖可以看出，無論是酶處理時間還是紙漿濃度對MFC粒徑和比表面積的影響都不顯著，而從表8可以看出，BC交叉作用的P值也較大，所以酶處理時間和紙漿濃度的交互作用很弱。

圖6 酶用量與酶處理時間的等高圖和響應曲面

圖7 酶用量與紙漿濃度的等高圖和響應曲面

圖8 酶處理時間與紙漿濃度的等高圖和響應曲面

序號酶用量/U·g-1酶處理時間/h紙漿濃度/%粒徑/μm比表面積/m2·g-1110.5324.0010.0039.6634.29推薦210.3224.0010.0039.6234.28310.1024.0010.0039.5934.28411.5624.0010.0039.8734.31510.2023.9810.0039.6334.27611.7524.0010.0039.9234.31710.5423.9510.0039.7234.27810.0024.0010.0039.6834.25912.8524.0010.0040.2334.311010.2724.009.8340.0234.21

2.2.3 工藝優化

進一步通過Design-Expert軟件分析計算，綜合考慮酶用量、酶處理時間、紙漿濃度等因素，得出MFC粒徑較小、比表面積較大時，確定最佳優化條件為：酶用量10.53 U/g，酶處理時間24 h，紙漿濃度10%。

3 結 論

響應曲面法(RSM)和纖維素酶預處理制備微纖化纖維素(MFC)工藝，都是目前較為常見的研究主題，本研究將兩者結合起來，利用RSM優化酶解法制備MFC工藝，根據RSM進行實驗設計和模型建立，得出MFC粒徑及其比表面積與紙漿濃度、酶用量和酶預處理時間的二次回歸模型，回歸模型對MFC粒徑和比表面積的響應顯著。通過RSM的優化預測功能得出酶預處理制備MFC的優化條件為：酶用量為10.53 U/g，酶處理時間為24 h，紙漿濃度為10%。這對于MFC的酶預處理制備具有一定的指導意義。

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(責任編輯：常 青)

Parameter Optimization of Cellulase Pretreatment for MFC Preparation Based on RSM Model

ZHANG Qi-lian ZHANG Zheng-jian*CHEN Yun-zhi LI Zhi-hong

(College of Packaging and Printing Engineering, Tianjin University of Science and Technology, China Light Industry Key Lab of Food Packaging Materials and Technology, Tianjin, 300222)(*E-mail: zhangzj@tust.edu.cn)

The response surface method (RSM) was used to optimize the process conditions of cellulase pretreatment for MFC preparation in this study. At first, the single factor analysis of the properties of MFC were conducted by Malvern particle size analyzer and Congo red staining method; then, RSM analysis method was used to optimize the process conditions using the particle size and specific surface area of MFC as the response values. The results showed that the changes of pulp concentration, cellulase dosage and cellulase pretreatment time had a certain influence on the performance of MFC. It was concluded that the optimized conditions of cellulase pretreatment for MFC preparation were as follows: the pulp concentration was 10%, the cellulase dosage was 10.53 U/g, and the cellulase pretreatment time was 24 h.

microfibrillated cellulose; response surface method; particle size; specific surface area; parameter optimization

張啟蓮女士，在讀碩士研究生；主要研究方向：微纖化纖維素的制備及薄膜應用。

2017- 04- 09(修改稿)

TS72

A

10.11980/j.issn.0254- 508X.2017.07.001

*通信作者：張正健，副教授；主要研究方向為微納米纖維素的制備及應用。