腎移植術后患者西羅莫司血藥濃度的測定

鄒 靜，肖洪濤，李晉奇，師健友，王 婷

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院藥學部，四川 成都 610072)

腎移植術后患者西羅莫司血藥濃度的測定

鄒 靜，肖洪濤，李晉奇，師健友，王 婷

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院藥學部，四川 成都 610072)

目的 建立腎移植術后患者西羅莫司血藥濃度的液相色譜-質譜聯(lián)用(HPLC-MS)測定方法。方法選取服用FK506/CsA+西羅莫司+糖皮質激素三聯(lián)免疫治療的腎移植術后患者20例，采集西羅莫司谷濃度全血樣本，以達那唑為內標，經(jīng)沉淀蛋白及液液萃取處理后，經(jīng)液相色譜分離，采用ESI離子源，以SIR正離子方式進行檢測，檢測離子為m/z 936.76(西羅莫司)，m/z 338.26(內標)。同時將所建立的HPLC-MS法和微粒子酶免疫法(MEIA)分別測定腎移植患者全血西羅莫司濃度，評價兩種分析方法測定結果的一致性。結果西羅莫司在0.2～100 μg/L范圍內線性關系良好(r=0.9992)，最低定量限為0.2 μg/L。日內、日間精密度均小于6%，方法學回收率為92.93%～102.98%。兩種方法測得的數(shù)據(jù)相關系數(shù)為0.979(P＜0.05)，兩組數(shù)據(jù)間存在相關性(n=20)。當西羅莫司濃度在1.9～11.1 μg/L時，兩種方法測定的平均偏差為1.4 μg/L。結論本文建立的HPLC-MS測定方法快速、準確、靈敏、選擇性高，適用于臨床對西羅莫司的血藥濃度監(jiān)測;HPLC-MS法和MEIA法測定西羅莫司全血濃度存在相關性，同一份樣本用MEIA測定的濃度均值比HPLC-MS法測定的值高。

西羅莫司;達那唑;高效液相色譜法-質譜聯(lián)用;血藥濃度監(jiān)測;微粒子酶免疫法

西羅莫司(雷帕霉素)是由鏈霉菌屬產(chǎn)生的大環(huán)內酯類抗生素，是一種療效好、低毒、尚未發(fā)現(xiàn)有明顯腎毒性的免疫抑制劑［1］，因西羅莫司引起的可逆性副作用，如高脂血癥、白細胞及血小板減少癥、肺炎增加傾向等，在血藥濃度由30 μg/L降至15 μg/L后均有好轉［2］，因此當器官移植后出現(xiàn)肝腎功能不全或他克莫司(FK506)、環(huán)孢霉素(CsA)不能達到理想的藥物濃度時，西羅莫司是作為替換治療或輔助治療的最佳選擇之一。

西羅莫司有效血藥濃度范圍窄，其口服生物利用度僅為14%～15%［3］，且由于患者疾病狀態(tài)、器官移植類型、年齡、劑量等因素在藥物吸收和代謝上都可能存在個體差異，因此不易估計給藥后的血藥濃度。此外，治療過程中的合并用藥、影響細胞色素P4503 A酶系的藥物都能引起血藥濃度的改變。對大部分患者而言，藥物的療效、毒副作用與血藥濃度成正相關，因此測定個體血藥濃度以調整用藥的劑量和次數(shù)、制定個體化治療方案在臨床上有著至關重要的意義。HPLC法測定西羅莫司濃度的方法已有文獻報道［4～6］。但這些方法中有的采用較為昂貴的LC-MS/MS，有些尚需難以獲得的特殊內標。本文建立用LC-MS法測定SRL的全血藥物濃度，以滿足醫(yī)院對其進行血藥濃度監(jiān)測的日常需求。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 腎移植術后患者血藥采集 2011年5月～7月選取服用FK506/CsA+西羅莫司+糖皮質激素三聯(lián)免疫治療的腎移植術后患者20例，年齡20～65周歲，處于腎移植穩(wěn)定狀態(tài)。患者口服西羅莫司劑量為1～2 mg/天，1次/天，西羅莫司血藥濃度首次測定可在術后第7～10天后的谷值血藥濃度，第1個月內每周測定1～2次，第2個月每周測定1次，之后每個月測定1次，采血時間為即將服西羅莫司前抽血。

1.1.2 試劑與儀器 西羅莫司測定試劑盒與西羅莫司質控及校準品系列，均為美國Abbott公司提供。Waters 2695高效液相色譜儀(美國 Waters公司)，含系統(tǒng)控制器，四元低壓梯度輸液泵，全自動進樣器，柱恒溫箱，MassLynx4.0色譜數(shù)據(jù)工作站;色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18(100×2.1 mm，3.5 μm);BP211D電子分析天平(德國沙多利斯公司);IMx分析儀(美國Abbott公司)。甲醇(色譜純，美國Fisher公司)，乙腈(色譜純，美國Fisher公司);水為超純水;對照品:西羅莫司對照品(批號:0709022P，純度:99.5%，浙江省藥品檢驗所);內標達那唑(I．S．)對照品(批號:100126-200402，供含量測定用，中國藥品生物制品檢定所)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 流動相:H2O-乙腈-甲醇 (27:45:28，v/v);流速:0.2 ml/min，柱溫:60 ℃。

1.2.2 質譜條件 電噴霧電離源(ESI+)，采用選擇離子監(jiān)測模式同時測定西羅莫司(［M+Na］+，m/z 936.76)，內標達那唑(［M+H］+，m/z 338.26);毛細管電壓3.4 kV;椎孔電壓(西羅莫司72 V，達那唑28 V);二級椎孔電壓2 V;六級桿透鏡電壓0.2 V;源溫度120℃;脫溶劑氣溫度350℃;脫溶劑氣流量700 L/h;錐孔氣流量50 L/h。

1.2.3 溶液、標準曲線和質控樣品的配制 ① 對照品溶液:精密稱取西羅莫司對照品5.03 mg(相當于西羅莫司 5.005 mg)，以甲醇溶解，并定容于25 ml容量瓶中，混勻即成西羅莫司儲備液(200.19 mg/L)。取西羅莫司儲備液2.5 ml，以50%甲醇定容于50 ml容量瓶中，即得西羅莫司工作液(10.01 mg/L)，置-30℃冰箱儲存?zhèn)溆谩＂趦葮巳芤?精密稱取達那唑標準品5 mg，以50%甲醇水溶液溶解，并定容于25 ml容量瓶中，即得內標儲備液(200 mg/L)。取內標儲備液1 ml，以50%甲醇水溶液定容于50 ml容量瓶中，即得內標工作液(4 mg/L)，置4℃冰箱儲存?zhèn)溆谩＂蹣藴是€的制備:取西羅莫司工作液(10.01 mg/L)0.1 ml，置于10 ml容量瓶中，以空白人全血定容，混勻即得西羅莫司全血濃度100.1 μg/L，再以空白人全血按對倍稀釋，配成各含50.05、20.02、10.01、5.005、2.002、1.001、0.5005、0.2002 μg/L西羅莫司的全血樣品，置-30℃冰箱儲存?zhèn)溆谩＂苜|控樣品的配制。精密稱取西羅莫司對照品4.97 mg(相當于西羅莫司4.945 mg)，以甲醇溶解，并定容于25 ml容量瓶中，混勻即成西羅莫司儲備液(197.81 mg/L)。取西羅莫司儲備液2.5 ml，以50%甲醇定容于50 ml容量瓶中，即得西羅莫司溶液(9.89 mg/L)，取9.89 mg/L的西羅莫司溶液0.08 ml，置于10 ml容量瓶中，以空白人全血定容，混勻即得西羅莫司全血高質控樣品，濃度79.12 μg/L，再按此法配制得西羅莫司中質控樣品(19.78 μg/L)，低質控樣品(0.495 μg/L)，置-30 ℃ 冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 樣品預處理 取全血樣品0.1 ml，加入25 μl內標工作液，漩渦混勻，加入5%ZnSO4、丙酮各150 μl，漩渦混勻 6 分鐘后，12000 rpm，6 ℃離心 6 min，轉移上清液于另一潔凈圓底玻璃試管，加入4 ml叔丁基甲醚，漩渦萃取8 min，3000 rpm，6℃離心8 min，轉移上層有機相于另一尖底試管;于(45±5)℃水浴通氮氣流吹干。殘渣加入80%甲醇120 μl旋渦混合1 min，加入環(huán)己烷2 ml旋渦萃取4 min，2200 rpm，6℃離心4 min，吸棄上層有機相，取下層水相10 μl進樣。記錄西羅莫司和內標離子流色譜圖的色譜峰面積，計算西羅莫司和內標的峰面積比，從標準曲線求算樣品中西羅莫司濃度。

1.2.5 方法學考察 ①標準曲線和線性范圍:取標準曲線全血樣品0.1 ml，加入25 μl內標工作液，按照“1.2.4樣品預處理”進行操作，記錄西羅莫司和內標離子流色譜圖的色譜峰面積，以西羅莫司和內標峰面積比對應其濃度進行線性回歸，考察線性。②精密度與回收率試驗:取高、中、低質控樣品各0.1 ml，于同批內連續(xù)測定5次，將記錄峰面積比代入當日線性回歸方程，計算西羅莫司濃度，以測得值與理論加入值之比計算方法學回收率，得到批內精密度與回收率;在不同天連續(xù)分3批每濃度各測定5次，計算批間精密度與回收率。③萃取回收率試驗:按標準曲線方法配制并測定 100.1、10.01、0.495 μg/L三個濃度血樣，每個濃度平行測定3份，所得峰面積與對照品溶液直接進樣所得峰面積進行比較，計算萃取回收率。④基質效應:將高、中、低(79.12、19.78、0.495 μg/L)質控樣品，按“1.2.4樣品處理”操作，進樣得峰面積A1，用相同體積的純水代替空白全血，按“1.2.4樣品處理”操作，記錄色譜圖峰面積A2，將A1與A2相除，即得絕對基質效應。⑤穩(wěn)定性考察:根據(jù)樣品測定過程中可能遇到的不穩(wěn)定因素，實驗先后考察了工作液-20℃保存的穩(wěn)定性;全血樣品在4℃放置7天的穩(wěn)定性，和在－30℃保存0、8、14及30天的穩(wěn)定性;全血樣品反復凍融0、1、2次的穩(wěn)定性;測定樣品處理完后立即進樣與室溫放置4 h后進樣的結果差異。

1.2.6 LC-MS法與MEIA法測定比較 目前，測定西羅莫司血藥濃度的方法主要為免疫法和LC-MS法，因此將所建立的LC-MS法與微粒子酶免疫分析法(MEIA法)對同一樣品的測定結果進行比較，考察兩種測量方法的一致性。對于之前選擇的20例腎移植術后患者，在采集谷濃度血樣時，取其靜脈血樣2～3 ml，立即移入經(jīng)EDTA處理的試管中，充分混勻，平均分為兩份，分別采用LC-MS法和MEIA法進行測定。

MEIA法測定的主要步驟為:精確吸取樣本全血150 μl加入離心管中，精確加入150 μl沉淀劑，振搖10秒，離心5分鐘，轉速10000轉/分，取上清液150 μl置雅培IMx分析儀內，IMX分析儀將自動檢測并打印結果。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，以MEIA法所測的值為X變量，LC-MS法所測的值為Y變量，進行雙變量相關分析，考察測定結果相關性。采用 MedCalc 17.4.4統(tǒng)計軟件，進行 Bland-Altman分析，考察兩個測量方法的一致性。

2 結果

2.1 方法專屬性在選定測定條件下，根據(jù)質譜分析結果，進行SIR監(jiān)測，西羅莫司和內標的m/z分別為936.76和338.26。空白血漿、西羅莫司和內標加空白血漿及血漿樣品色譜圖見圖1～3。空白血漿中內源性雜質和代謝物不干擾西羅莫司及內標物的測定，保留時間分別為3.07 min和7.52 min。

2.2 方法學考察結果西羅莫司全血標準曲線回歸方程:Y=7.63×10-3X+1.55×10-4(r=0.9992，weighting=1/X2)。表明西羅莫司在0.2002～100.1 μg/L范圍內線性良好，最低定量限為0.2002 μg/L，其RSD為6.58%。萃取回收率試驗結果顯示，SRL萃取回收率為53.6%～58.9%。經(jīng)試驗測定計算高、中、低質控樣品中基質效應分別為(97.01±6.52)%、(103.01±5.64)%及(93.0±8.25)%，RSD分別為9.3%、7.7%、11.1%。高、中、低質控樣品精密度與回收率試驗結果見表1。

穩(wěn)定性考察結果顯示，工作液－20℃冷凍保存29 d均能保持穩(wěn)定，滿足測定要求。西羅莫司全血樣品在－30℃保存30 d，西羅莫司濃度結果穩(wěn)定。對比測定凍融0、1、2次的全血樣品以及4℃放置7 d的全血樣品，測定結果表明，在凍融和4℃放置條件下西羅莫司濃度結果穩(wěn)定。對比測定樣品處理完后立即進樣與室溫放置4 h后進樣，測定結果表明，預處理后殘留物復溶后放置4 h西羅莫司測定結果穩(wěn)定。

圖1 LC-MS色譜圖-空白全血 a:總離子色譜圖;b:m/z 338.26色譜圖;c:m/z 936.76色譜圖;1:內標，2:西羅莫司

圖2 LC-MS色譜圖-空白全血加標液 a:總離子色譜圖;b:m/z 338.26色譜圖;c:m/z 936.76色譜圖;1:內標，2:西羅莫司

圖3 LC-MS色譜圖-腎移植術后患者口服西羅莫司后全血樣品 a:總離子色譜圖;b:m/z 338.26色譜圖;c:m/z 936.76色譜圖;1:內標，2:西羅莫司

表1 SRL在人全血中的方法學回收率與批內、批間精密度 (n=5)

2.3 統(tǒng)計分析結果雙變量相關分析得出，r=0.979(P＜0.05)，提示兩組數(shù)據(jù)間存在相關性，回歸方程為Y=0.729X+0.1021。收集的20份樣本濃度在 1.9～11.1 μg/L，相對于 LC-MS，MEIA 的平均百分偏差為32.3%，平均偏差為1.43 μg/L。對兩組數(shù)據(jù)進行Bland-Altman偏差分析，見圖4。結果顯示，同一份樣本用 MEIA測定的濃度均值比HPLC-MS法測定的值高。

圖4 兩種方法測定數(shù)據(jù)的絕對平均偏差

3 討論

因SRL的有效治療濃度范圍較低4～10 μg/L，因此SRL的測定方法必須考慮到檢測靈敏度與分離效果的問題。目前微粒免疫測定法(MEIA)和高效液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用法(HPLC-MS/MS)常用來測定西羅莫司血藥濃度，盡管HPLC-MS/MS分離能力好、高靈敏度且快速的儀器優(yōu)勢，但儀器昂貴的價格亦限制了其應用的普遍性，而在進行有效的樣品預處理后，選擇HPLC-MS進行檢測，同樣可以達到HPLC-MS/MS的檢測靈敏度。故本文選擇HPLC-MS法對西羅莫司的血藥濃度進行了測定。

西羅莫司吸收入血后，95%分布于紅細胞內，少部分與血漿脂蛋白結合［7］，因此測定西羅莫司 的血藥濃度需用全血。血樣的預處理先必須充分破壞紅細胞，并沉淀蛋白，使西羅莫司從中分離出來，便于提取，隨后還須將全血中的各種內源性雜質進行去除，以避免干擾西羅莫司的測定。固相萃取辦法雖高效、可靠，但成本過高;而直接沉淀蛋白法雖然簡便，但提取物中內源性物質較多，基質效應較高，因此在樣品預處理方法的建立階段，作者參考國內外同行的已報道方法［6，8］，并根據(jù)實驗室現(xiàn)有條件，決定采用液液萃取方式處理樣品，同時選擇較易獲取的達那唑作為內標，以提高本方法的通用性。作者對流動性的配比、色譜條件、質譜條件也進行了不斷優(yōu)化，最終確定的流動相、樣品處理方法與質譜條件，進一步提高了本方法的靈敏度。

本研究還比較分析了MEIA與HPLC-MS兩種方法測定結果的差異，并給出兩種方法之間轉換的定量關系，方便臨床醫(yī)生對TDM的結果解讀;同時建立測定全血西羅莫司濃度的LC-MS法，可用于臨床西羅莫司的濃度監(jiān)測。體內西羅莫司主要經(jīng)肝微粒體細胞色素P450酶系代謝為具有結構相似的去甲基化、羥基化成無免疫抑制活性的產(chǎn)物，而臨床藥理學活性主要由西羅莫司母藥產(chǎn)生［9］。MEIA法是非特異性的，可與代謝產(chǎn)物發(fā)生交叉反應，與專門針對母體分子的LC-MS檢測法相比，交叉干擾能夠導致測定結果產(chǎn)生固定的正偏差［10］。本研究結果顯示，MEIA法測定相對于LC-MS測定值明顯偏高，與西羅莫司體內代謝特征及兩種測定方法的原理相符合。

因此本文建立的LC-MS法測定腎移植術后患者西羅莫司血藥濃度快速、準確、靈敏、選擇性高，與Abbott IMx測定西羅莫司的免疫分析法比較均有較好的相關性，但LC-MS法能避免免疫分析方法中交叉免疫所造成的測定值偏高，更適用于臨床對西羅莫司的血藥濃度監(jiān)測，尤其適用于腎移植術后以西羅莫司作為輔助用藥時，西羅莫司血藥濃度較低者的含量測定。

［1］Stepkowski SM，Chen H，Daloze P，et al．Rapamycin，a potent immunosuppressive drug for vascularized heart，kidney，and small bowel transplantation in the rat［J］．Transplantation，1991，51(1):22-26．

［2］Hong JC，Kahan BD．Sirolimus induced thrombocytopenia and leukopenia in renal transplant recipients:Risk factors，incidence，progression，and management［J］．Transplantation，2000，69:2085-2098．

［3］Kahan BD，Wong RL，Carter C，et al．A phase I study of a 42 week course of SDZ-RAD(RAD)quiescent cyclosporine-prednisone-treated renal transplant recipients［J］．Transplantation，1999，68(8):1100-1106．

［4］Panos H，Dietrich AV．Evaluation of a cyano stationary phase for the determination of tacrolimus，sirolimus and cyclosporin A in whole blood by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］．J Chromatogr B，809(2004):287-294．

［5］時穎華，李中東，施孝金，等．HPLC法測定人全血中西羅莫司的濃度［J］．中國臨床藥學雜志，2004，13(2):76-78．

［6］黃明珠，胡興江，陳俊春，等．西羅莫司全血濃度測定方法及臨床應用［J］．中國臨床藥理學雜志，2014，30(5):445-447．

［7］Yatscoff RW，Wang P，Chan K，et al．Rapamycin:distribution，pharmacokinetics，and therapeutic range investigations ［J］．Ther Drug Monit，1995，17(6):666-671．

［8］徐紅冰，胡道德，陳桂良，等．HPLC法檢測腎移植患者全血中西羅莫司的藥物濃度［J］．藥學服務與研究，2004，4(2):152-154．

［9］Leung LY，Lim HK，Abell MW，et al．Pharmacokinetics and metabolic disposition of sirolimus in healthy male volunteers after a single oral dose［J］．Ther Drug Monit，2006，28:51-61．

［10］Schmid RW，Lotz J，Schweigert R，et al．Multi-site analytical evaluation of a chemiluminescent magnetic microparticle immunoassay(CMIA)for sirolimus on the Abbott ARCHITECT analyzer［J］．Clin Biochem，2009，42:1543-1548．

Determination of blood concentrations of sirolimus in patients after renal transplantation

ZOU Jing，XIAO Hong-tao，LI Jin-qi，SHI Jian-you，WANG Ting (Department of Pharmacy，Sichuan Academy of Medical Science ＆ Sichuan Provincial People's Hospital，Chengdu 610072，China)

Objective To develop a HPLC-MS method for determination of blood sirolimus(SRL)concentrations in patients after renal transplantation．MethodsWe selected 20 patients who

a triple immunotherapy of FK506/CsA+Sirolimus+glucocorticoids after rental transplantation．The whole blood samples were collected．To determine the concentrations of SRL，danazol was used as the internal standard(IS)，and SRL and IS were separated on a Zorbax SB-C18 Narrow Bore RR(100 × 2.1 mm，3.5 μm)with a mobile phase containing H2O-acetonitrile-methanol(27:45:28，v/v)at a flow rate of 0.2 ml/min and temperature of the column is 60 ℃following protein precipitation and a simple two-step liquid-liquid extraction procedure．The mass spectrometer was operated in the positive ion mode，and selective ion monitors(SIM)were at m/z 936.76(［M+Na］+)for SRL and 338.26(［M+H］+)for internal stand-ard，respectively．At the same time，a microparticle enzyme immunoassay(MEIA)was also used to determine blood SRL concentrations．The consistency of results by the HPLC-MS method MEIA was analyzed．ResultsCalibration curves were linear(r=0.9992)between 0.2 and 100 μg/L of SRL and the sensitivity was 0.2 μg/L．Intraday and inter-day precision was less than 6%．Analytical recovery ranged from 92.93%to 102.98%．The correlation coefficient of the two methods was 0.979(P＜0.05)suggesting a close correlation between the two methods(n=20) ．An average deviation of the two methods was 1.4 μg/L when blood SRL concentrations ranging from 1.9 to 11.1 μg/L．ConclusionThe HPLC-MS method described herein had been successfully applied for TDM in adult renal transplant recipients due to its low limits of quantification and stability．There is a correlation between the HPLC-MS and MEIA in determination of blood RSL concentrations．However，the average concentration values of the same sample are higher using MEIA when compared to HPLC-MS method．

Sirolimus;Danazol;HPLC-MS;TDM;MEIA

R965

A

1672-6170(2017)04-0036-05

2017-02-03;

2017-04-03)

2015年四川省人民醫(yī)院青年基金立項資助項目(編號:2015QN05)