黃芪六一湯對2型糖尿病治療效果的轉錄組學研究

常越　徐姣　閆嵩　劉振鵬　任偉超　張開雪　馬偉　劉秀波

[摘要]該實驗采用Illumina測序平臺對大鼠胰腺進行轉錄組測序，對靶點進行表達量統計，分析空白組、模型組、黃芪六一湯組三者之間的表達差異關系，探究黃芪六一湯對2型糖尿病的治療效果，并探討其作用機制。結果表明，通過eggNOG對基因進行分類分析，其中有2425%的基因屬未知功能類，為最大分類單元，其余依次為能量轉換類、氨基酸轉運和代謝類、核苷酸轉運和代謝類、碳水化合物轉運和代謝類、輔酶轉運和代謝類、脂質轉運和代謝類等；根據KEGG富集分析，黃芪六一湯可能在環境信息處理、細胞過程、生物系統、人類疾病這4類代謝通路上對2型糖尿病起到治療作用。研究表明，黃芪六一湯能顯著改善2型糖尿病大鼠空腹血糖、糖化血紅蛋白。

[關鍵詞]黃芪六一湯； 2型糖尿病； 轉錄組學； eggNOG分析； KEGG富集分析

[Abstract]In this study， Illumina sequencing platform was applied in sequencing rat pancreas， counting expression of target points， analyzing expression differences among blank group， model group and Huangqi Liuyi decoction group and exploring the therapeutic effect and mechanism of Huangqi Liuyi decoction on type 2 diabetes mellitus According to the result， 2425% of these genes belonged to the unknown functional class， which was the largest classification unit according to the classification analysis of genes by eggNOG The rest were classified as energy conversion， amino acid transport and metabolism， nucleotide transport and metabolism， carbohydrate transport and metabolism， coenzyme transport and metabolism， and lipid transport and metabolism， etcHuangqi Liuyi decoction may play a therapeutic role in the treatment of type 2 diabetes mellitus through four metabolic pathways， namely environmental information processing， cellular process， organismal system and human diseases according to KEGG enrichment analysis This study shows that， Huangqi Liuyi decoction can significantly improve the fasting blood glucose and glycosylated hemoglobin in type 2 diabetic rats

[Key words]Huangqi Liuyi decoction； type 2 diabetes mellitus； transcriptomics； eggNOG analysis； KEGG enrichment analysis

糖尿病是一種以失控的高血糖為主要表現，多種并發癥為主要損害的一種代謝性疾病，病程長且復雜，難以根治，已嚴重影響人們的健康生活[1]。中藥及中藥復方對糖尿病起到了治療作用，常用中藥有人參、黃芪、地黃、甘草等[2]。其中，黃芪多糖可抑制由內質網壓力引起的活化轉錄因子的活性，增加2型糖尿病大鼠肝臟組織中的AMPK磷酸化水平，降低蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B） 的過表達，以提高大鼠胰島素敏感性，增加KKAy大鼠對高血糖癥和口服葡萄糖的耐受性[36]。Honda K等[7]將減少血漿胰島素濃度作為改善胰島素抵抗的指標，并通過實驗證明甘草總黃酮明顯降低血漿胰島素濃度，因此推測甘草總黃酮能改善胰島素抵抗。黃芪六一湯由黃芪、炙甘草組成，具有補氣、生津等功效。轉錄組（transcriptome）是指特定細胞在某一功能狀態下全部表達的基因總和，代表了每一個基因的身份和表達水平，轉錄組測序能全面的地揭示生物個體在特定組織和特定時期的全局基因的表達情況[8]。本實驗通過黃芪六一湯對2型糖尿病治療效果轉錄組學的研究，表明黃芪六一湯可能通過改善新陳代謝通路從而對2型糖尿病起到治療作用。

1材料

11動物選用SPF級雄性大鼠40只，體質量（200±20） g，鼠齡6～8周（黑龍江中醫藥大學藥物安全評價中心），許可證號SCXK（黑）2013004。動物飼養于SPF級動物實驗室，實驗室溫度（22～24 ℃），濕度（45%～55%），日光照12 h，動物分籠飼養（10只/籠），自由覓食飲水。實驗過程中對動物處置符合動物實驗倫理標準。

122型糖尿病大鼠模型構建目前得到2型糖尿病大鼠的方法有2種，第1種是直接購買基因敲除的大鼠，第2種就是國內廣大研究人員普遍采用的造模方法[9]，即采用鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射獲得2型糖尿病大鼠。綜合實驗技術熟練程度、資金等方面因素，采用STZ腹腔注射的方法復制2型糖尿病大鼠模型。

取大鼠40只，適應飼養7 d后，隨機選取10只作為空白對照組，空白對照組給予普通飼料，其余30只大鼠給予高糖高脂飼料3周。3周后，大鼠禁食12 h后腹腔注射檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液（pH 45）溶解的STZ（40 mg·kg-1），配置STZ后冰浴并快速注射，以免藥物降解藥效失效。空白對照組腹腔注射等劑量的檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液。末次給藥72 h后禁食12 h檢測血糖，將血糖≥167 mmol·L-1確定為糖尿病大鼠，共得到造模成功大鼠26只。

13分組及干預方法選取造模成功大鼠中的20只并隨機分成2組。分為模型對照組、黃芪六一湯組。空白對照組、模型對照組：造模后第7天開始給予生理鹽水10 mL·kg-1·d-1；黃芪六一湯組：造模后第7天按照鼠人折算劑量分別以不同藥物灌胃，灌服中藥黃芪六一湯（生藥1260 g·kg-1），1次/d；給藥量=人體給藥量×0018×20。大鼠每周稱重1次，按照體重調整灌胃劑量，連續灌胃4周。

本實驗選擇實驗4周后空白組、模型組、黃芪六一湯組大鼠胰腺作為轉錄組測序實驗材料。大鼠末次給藥后禁食12 h，用20%烏拉坦溶液對大鼠腹腔注射麻醉。麻醉后，快速取胰腺組織，鋁箔包裹并迅速凍存于液氮中，然后凍存于-80 ℃冰箱。

14黃芪六一湯的制備工藝取黃芪飲片600 g和甘草飲片100 g，加水2 L，浸泡2 h，煎煮1 h，濾過，回收濾液；藥渣加水2 L，煎煮05 h，濾過，棄去濾渣，合并濾液，減壓濃縮至700 mL。藥液置于棕色瓶中，密封儲存于4 ℃冰箱備用。

2方法

21大鼠胰腺總RNA的提取與質檢采用天恩澤柱式動物RNAout試劑盒（CAT#：71201）對樣品進行RNA提取。采用15%瓊脂糖凝膠電泳對獲得的總RNA完整性檢測，表明RNA條帶完整，無降解。利用紫外分光光度計對RNA進行定量檢測，達到要求濃度，且A260/A280大于18。

22轉錄組文庫構建第一步：mRNA的純化，采用Illumina的TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit。針對真核生物mRNA特有的poly A結構，利用oligo dT磁珠捕獲mRNA。

第二步：反轉錄及cDNA文庫構建，采用Illumina的TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit。

第三步：cDNA文庫構建，首先是3′端加A，在這一過程中，DNA的3′端會單獨加上一個A堿基，以防止DNA片段的自連，同時保證DNA與3′端有一個突出T堿基的測序接頭相連，而后加一個有特異性標簽的接頭，此過程是為了讓DNA最終雜交到Flow Cell上。

23cDNA文庫質檢與測序首先取1 μL cDNA文庫，采用Agilent Bioanalyzer 2100對構建的文庫進行質檢。利用QuantiT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor上對文庫進行定量分析。對合格cDNA文庫，進行轉錄組測序。測序由上海派森諾生物科技有限公司完成，采用Illumina NextSeq 500 High Output Kit（300cycles）測序平臺進行2×150 bp的雙端測序。測序樣品為大鼠胰腺RNASeq文庫。

24原始數據過濾及質控分析符合要求的測序數據序列經過進一步除去低質量序列和接頭序列，減少對后續分析的影響。數據過濾標準為：①去除Reads 接頭序列；②從Reads 3′端向5′端去掉平均質量小于Q20的部分（5 bp窗口）；③去除最終長度小于50 bp的序列；④序列中沒有不確定堿基。原始數據通過質量過濾后，通過FastQ（http：//www. bioinformatics. babraham. ac. uk/projects/fastqc/）進行質量過濾質控分析。

3結果與分析

31大鼠胰腺轉錄組原始數據統計樣品通過上機測序，得到的最原始的測序數據以FASTQ格式的形式儲存。下機原始數據每個樣本的Reads數以及數據總量見表1。

32大鼠胰腺轉錄組原始數據過濾統計對大鼠胰腺轉錄組數據分別統計，統計結果見表2。通過對轉錄組數據質量過濾質控結果分析可知，本次測序過濾后的數據平均質量很高，基本分布在Q>28區域。絕大部分Reads質量都分布在35左右，說明整體Reads平均質量都很高。一般而言5′端堿基的ATGC百分比會有所波動，中間和3′端堿基比較穩定，A與T大致相等，C與G大致相等。曲線形狀的偏差較小，本次實驗理論值與實測值符合較好。

33比對到基因組（Mapping）參照基因組：Rattus_norvegicusRnor_60dnatoplevelfa （ftp：//ftpensemblorg/pub/release80/fasta/rattus_norvegicus/dna/）。分析軟件：bowtie2/tophat2 （http：//tophatcbcbumdedu/）。樣本比對到基因組上的數據見表3。

34eggNOG分析eggNOG（evolutionary genealogy of genes： nonsupervised orthologous decoctions） 是一個包含943種細菌，69種古生菌和121個真核生物的直系同源蛋白質聚類數據庫[1011]。根據先前的研究，蛋白質可分為25個功能類別。eggNOG數據庫包括蛋白質直系同源簇（COGs）數據庫和KOG數據庫。將得到的Unigene進行KOG注釋后，歸入適當的KOG簇，由此對基因組的所有基因功能做分類統計，從宏觀上認識該物種的基因功能分布特征。

經對大鼠轉錄組數據處理，共有3 777條unigene（9999%），eggNOG共分26類。其中“未知功能”（916條，占比2425%）；僅一般功能預測（619條，占比1639%）在eggNOG中是2個最大的分類單元。“翻譯后修飾，蛋白轉換，分子伴侶”（334條，占比884%）；“信號轉導機制”（301條，占比797%）；“翻譯，核糖體結構和生物轉化”（210條，占比556%）。“細胞運動”（5條，占比013%），“真核細胞外結構”（3條，占比008%），“核結構”（1條，占比003%）有最少的直系同源基因，見圖1。

35KEGG富集分析京都基因與基因組百科全書庫數據庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）是系統分析基因功能和基因組信息的數據庫，它整合了基因組學、生物化學以及功能組學的信息[12]。KEGG數據庫有助于研究者把基因及表達信息作為一個整體的網絡進行研究。KEGG通路分類富集分析圖見圖2。

在模型組與空白組比較中，在代謝途徑分類中：參與脂類代謝的500個基因中含有43個差異表達基因（P=508×10-16）；參與Overview的227個基因中含有29個差異表達基因（P=141×10-15）；參與氨基酸代謝的352個基因中含有29個差異表達基因（P=982×10-11）；參與碳水化合物代謝的417個基因中含有30個差異表達基因（P=122×10-9）；參與其他氨基酸代謝的98個基因中含有9個差異表達基因（P=0000 137）；參與多糖生物合成與代謝的276個基因中含有14個差異表達基因（P=0001 227）；參與異源物質的降解和代謝的156個基因中含有9個差異表達基因（P=0003 845）；參與輔助因子和維生素代謝的174個基因中含有9個差異表達基因（P=0007 753）；參與能量代謝的191個基因中含有10個差異表達基因（P=0004 726）。在遺傳信息處理分類中：參與折疊、分類和降解的408個基因中含有14個差異表達基因（P=0032 386）。在環境信息處理分類中：參與信號分子與互作的659個基因中含有20個差異表達基因（P=0038 102）。在細胞過程分類中：參與轉運和代謝的507個基因中含有22個差異表達基因（P=0000 503）。在生物系統分類中：參與內分泌系統的956個基因中含有44個差異表達基因（P=173×10-7）；參與消化系統的441個基因中含有32個差異表達基因（P=271×10-10）；參與環境適應的107個基因中含有7個差異表達基因（P=0005 281）。在人類疾病分類中：參與免疫系統疾病的390個基因中含有28個差異表達基因（P=461×10-9）；參與心血管疾病的237個基因中含有9個差異表達基因（P=0045 857）；參與內分泌代謝途徑的236個基因中含有18個差異表達基因（P=141×10-6）；參與傳染性疾病的1 983個基因中含有56個差異表達基因（P=0003 92）。

黃芪六一湯組與空白組比較，在新陳代謝分類中：參與脂類代謝的500個基因中含有22個差異表達基因（P=0000 944 667）。在環境信息處理分類中：參與信號轉導的2 114個基因中含有129個差異表達基因（P=714×10-30）；參與信號分子交互的659個基因中含有58個差異表達基因（P=172×10-20）。在細胞過程分類中：參與運輸和分解代謝的507個基因中含有27個差異表達基因（P=104×10-5）；參與細胞運動的167個基因中含有13個差異表達基因（P=532×10-5）；參與細胞間通信的384個基因中含有19個差異表達基因（P=0000 522 065）。在生物系統分類中：參與免疫系統的1 147個基因中含有125個差異表達基因（P=292×10-55）；參與內分泌系統的956個基因中含有63個差異表達基因（P=639×10-16）；參與消化系統的441個基因中含有34個差異表達基因（P=758×10-11）；參與發育的222個基因中含有17個差異表達基因（P=488×10-6）；參與環境適應的107個基因中含有9個差異表達基因（P=0000 420 574）；參與排泄系統的149個基因中含有9個差異表達基因（P=0004 249 559）；參與循環系統的277個基因中含有13個差異表達基因（P=0005 901 147）。在人類疾病分類中：參與感染性疾病的1 983個基因中含有193個差異表達基因（P=242×10-81）；參與免疫疾病的390個基因中含有57個差異表達基因（P=219×10-31）；參與內分泌代謝疾病的236個基因中含有24個差異表達基因（P=203×10-10）；參與癌癥的1 557個基因中含有69個差異表達基因（P=262×10-9）；參與心血管疾病的237個基因中含有23個差異表達基因（P=122×10-9）。

黃芪六一湯組與模型組比較，在新陳代謝分類中：參與Overview的227個基因中含有45個差異表達基因（P=6219 17×10-28），參與脂類代謝的500個基因中含有50個差異表達基因（P=260×10-17），參與糖代謝的417個基因中含有44個差異表達基因（P=323×10-16），參與氨基酸代謝的352個基因中含有35個差異表達基因（P=216×10-12），參與外來物質的降解和代謝的156個基因中含有19個差異表達基因（P=931×10-9），參與其他氨基酸代謝的98個基因中含有14個差異表達基因（P=112×10-7），參與能量代謝的191個基因中含有15個差異表達基因（P=744×10-5），參與其他次生代謝產物的生物合成的40個基因中含有5個差異表達基因（P=0002 761 753）。在環境信息處理分類中：參與信號轉導的2 114個基因中含有109個差異表達基因（P=304×10-14），參與信號分子相互作用的659個基因中含有43個差異表達基因（P=565×10-9）。在細胞過程分類中：參與轉運和分解代謝的507個基因中含有35個差異表達基因（P=392×10-8），參與細胞通訊的384個基因中含有18個差異表達基因（P=0006 641 926），參與細胞移動性的167個基因中含有10個差異表達基因（P=0008 067 433）。在生物系統分類中：參與免疫系統的1147個基因中含有97個差異表達基因（P=200×10-27），參與內分泌系統的956個基因中含有68個差異表達基因（P=216×10-15），參與消化系統441個基因中含有33個差異表達基因（P=142×10-8），參與環境適應性的107個基因中含有13個差異表達基因（P=211×10-6），參與發育的222個基因中含有14個差異表達基因（P=0001 170 584）。在人類疾病分類中：參與傳染性疾病的1 983個基因中含有182個差異表達基因（P=125×10-59），參與免疫系統疾病的390個基因中含有35個差異表達基因（P=394×10-11），參與內分泌代謝系統疾病的236個基因中含有23個差異表達基因（P=198×10-8），參與癌癥的1 557個基因中含有73個差異表達基因（P=561×10-8），參與心血管疾病的237個基因中含有20個差異表達基因（P=165×10-6）。

4結論與討論

通過對本實驗數據進行差異基因eggNOG分析后發現，“未知功能”分類所占比例最高，達到檢測基因總數的2425%，推斷可能是誘發糖尿病致病的未知基因。值得注意的是，“表皮生長因子受體”、“氨基酸轉運和代謝”、“核苷酸轉運和代謝”、“碳水化合物轉運和代謝”、“輔酶轉運和代謝”、“脂質轉運和代謝”也同樣有可能直接或間接影響2型糖尿病發生與發展。在糖代謝過程中，除了葡萄糖，果糖和甘露糖在糖尿病患者和空腹血糖異常人中含量也較高。當肝果糖代謝受到損傷，會中斷果糖的轉運，作用于多元醇通路可能導致血清果糖的增量。血清果糖的升高可能是誘發胰島素抵抗的原因之一，可能反過來影響葡萄糖代謝。在氨基酸代謝過程中：國外研究人員通過嵌入式病例對照研究發現3種支鏈氨基酸、2種芳香族氨基酸、酪氨酸和苯丙氨酸可作為健康人發展成糖尿病患者預測的重要指標[13]。研究人員通過橫斷面調查還發現α羥基丁酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺支鏈氨基酸在糖尿病患者中顯著升高[14]。在脂肪酸代謝過程中：目前，脂肪酸已為獨立預測糖尿病發展的因素，通過大量的脂肪溶解和游離脂肪酸增多（Randle cycle假說）、細胞內脂質衍生物的積累（如甘油二酯）、氧化應激反應、炎癥和線粒體功能障礙，進而影響胰島素作用機制[15]。

根據KEGG富集分析，模型組與空白組比較的顯著差異表達基因主要集中在新陳代謝、生物系統、人類疾病分類上；黃芪六一湯組與空白組比較的顯著差異表達基因主要集中在環境信息處理、細胞過程、生物系統、人類疾病分類上；黃芪六一湯組與模型組比較的顯著差異表達基因主要集中在新陳代謝、環境信息處理、細胞過程、生物系統、人類疾病分類上。對各組間KEGG富集分析圖分析，圖2中B與C顯著差異表達基因在環境信息處理、細胞過程、生物系統、人類疾病分類上的總體趨勢較為接近。但與A圖中這3類的總體趨勢差異較大。據此推測，黃芪六一湯可能在環境信息處理、細胞過程、生物系統、人類疾病這4類代謝通路上對2型糖尿病起到治療作用。在新陳代謝分類上，黃芪六一湯組的總體趨勢介于空白組與模型組之間，表明黃芪六一湯可能通過改善新陳代謝通路從而對2型糖尿病起到治療作用。

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[責任編輯張寧寧]