光合作用合成相關差異蛋白對應基因在高油酸油菜近等基因系中表達規律研究

王曉丹，肖 鋼，張振乾，官春云，陳社員，鄔賢夢，張詩遠

(湖南農業大學農學院/南方糧油作物協同創新中心，湖南 長沙 410128)

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光合作用合成相關差異蛋白對應基因在高油酸油菜近等基因系中表達規律研究

王曉丹，肖 鋼，張振乾*，官春云，陳社員，鄔賢夢，張詩遠

(湖南農業大學農學院/南方糧油作物協同創新中心，湖南 長沙 410128)

【目的】本文探索了光合作用相關基因表達與蛋白表達之間的關系，加速高油酸油菜育種進程。【方法】以高油酸油菜近等基因系出苗后7 d、5～6葉期和越冬期的葉片、花瓣和授粉后20～35 d的種子及角果皮為材料，利用定量PCR方法研究9個iTRAQ分析得到的差異蛋白對應基因在不同生育期表達規律。【結果】在出苗后7 d、花期和授粉后20～35 d，高油酸油菜的光合作用能力低于低油酸油菜；5～6葉期、越冬期高油酸油菜的光合作用能力高于低油酸油菜。gi|515616基因在高油酸油菜出苗后7 d去根材料及低油酸油菜5～6葉期、越冬期葉片和授粉后20～35 d角果皮中不表達，在花、授粉后20～35 d種子中均不表達。gi|297853098, gi|297825149和gi|312282567基因及gi|50313237和gi|79475768基因分別具有相同的表達規律。gi|297825149基因在高油酸油菜角果皮中是唯一上調表達基因。gi|312282897基因在高油酸油菜出苗后7 d去根材料為唯一上調表達基因。【結論】這些基因可作為高油酸油菜育種材料篩選的參考基因，加快育種進程。

實時熒光定量PCR；光合作用；高油酸油菜

【研究意義】蛋白質組學是在大規模水平上研究蛋白質的特征，包括蛋白質的表達水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，被認為是在基因組學和轉錄組學之后，生物系統研究的下一步[1-2]。然而，蛋白質組的研究遠比基因組學復雜，蛋白質有很高的細胞特異性，即使是同一細胞的不同時期或在不同的環境下，它表達的蛋白質也不盡相同[3]；同時，機體所處的不同環境和本身的生理狀態差異，會導致基因轉錄產物有不同的剪切和轉譯成不同的蛋白，一個基因可能會產生幾個，甚至幾十個蛋白質[4]。iTRAQ技術是2004年新開發的同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技術[5]，可以對樣本中的幾乎所有蛋白質進行標記，從而獲得更為詳盡的樣品信息[6]，重復性和穩定性高[7]。該技術在油菜分子生物學研究中也有不少應用[8-9]，本實驗室利用iTRAQ定量蛋白質組技術對高油酸油菜授粉后20～35 d種子進行分析[10]，得到與光合作用相關的差異蛋白。【前人研究進展】不同生育期及不同器官的基因表達情況對于作物性狀育種研究有十分重要的意義，Abdelghani N等[11]采用定量PCR方法研究了與脂肪酸合成相關的基因在高油酸低亞麻酸埃塞俄比亞芥中的表達規律，發現基因在種子外的器官中的表達情況在育種研究中也很有應用價值。Noelle A等[12]通過利用實時熒光定量PCR方法檢測高油酸花生及其野生型種子和葉片中FAD2基因表達量快速檢測高油酸花生基因型。同時，本實驗室對轉錄組分析得到的光合作用相關差異基因在不同生育期及不同器官中的表達情況研究發現，一些基因的表達有規律，可用于高油酸油菜育種材料早期篩選研究[13]。光合作用是生物界賴以存在的基礎，也是農作物產量形成的基礎[14]，作物中90 %以上的干物質直接來源于光合作用[15]，光合作用能力強有助于積累更多的干物質，獲得更高的產量[16]。呂亞等[17]以木薯栽培種ZM-QZ1 為材料，采用雙向電泳方法，研究一天中不同時間點葉片光合作用差異蛋白的變化。結果發現與光合作用相關的關鍵蛋白表達水平與凈光合速率在5 個時間點的變化趨勢一致，表明這些蛋白質的表達水平與光合作用強度密切相關。Silke H等[18]利用實時熒光定量PCR方法研究了光合作用相關基因在玉米葉片中表達情況。因此，研究光合作用相關的差異蛋白對應基因的表達規律對于了解基因與光合作用之間的關系、作物產量等方面研究有十分重要的意義。【本研究切入點】在本研究中，采用實時熒光定量PCR方法對與光合作用相關的差異蛋白對應基因在不同生育期的表達規律進行研究。【擬解決的關鍵問題】以期從中發現基因表達與蛋白表達之間的關系及不同油酸含量油菜的光合作用能力差異，為高油酸油菜育種提高參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

高油酸油菜近等基因系材料由湖南農業大學油料所提供。本試驗研究的基因為高油酸油菜近等基因系材料授粉后20～35 d種子iTRAQ分析得到光合作用相關差異蛋白(差異在1.5倍以上)對應基因。低油酸油菜(油酸含量56.2 %)為對照組，高油酸油菜(油酸含量81.4 %)為處理組。

儀器設備：Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(Thermo Scientific)，CFX96 CFX384熒光定量PCR(Bio-Rad)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備 在出苗后7 d去根幼苗，5～6葉期(2015年12月10日)和越冬期(2016年1月5日)頂部葉片，盛花期(2016年3月18日)的花(自交套袋)，在授粉后20～35 d(2015年4月17日)未成熟種子及角果皮，以上材料各取10株，混合保存于-80 ℃備用。

1.2.2 RNA提取 采用TransZol Up Plus RNA Kit(Trans Gene Biotech)提取總RNA，操作方法參照說明書。經Nanodrop 2000檢測濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA合格，保存于-80 ℃備用。

1.2.3 定量PCR研究 逆轉錄、引物合成及定量PCR研究參照文獻[13]。試驗進行3次，取平均值。需要進行研究的基因及其引物情況如表1所示。

2 結果與分析

2.1 出苗后7 d去根材料中基因表達情況

由圖1可知，gi|515616基因在高油酸油菜中不表達，gi|312282897基因在高油酸油菜中上調表達(3.544倍)，其余基因在高油酸油菜中下調表達，其中gi|297853098基因(15.743倍)、gi|6006279基因(13.0倍)差別較大，其次是gi|42571703基因(5.367倍)和gi|297825149基因(3.326倍)。在出苗后7 d，7個基因在高油酸油菜材料中下調表達，表明此時期高油酸油菜的光合作用能力低于低油酸油菜。

2.2 5～6葉期葉片中基因表達情況

從圖2可看出，gi|515616在低油酸油菜葉片中不表達，gi|297853098(2.837倍)，gi|312282897(3.950倍)在高油酸油菜葉片中下調表達，其余基因在高油酸油菜葉片中上調表達，其中gi|42571703(35.438倍)差別較大，其次是gi|297825149(4.754倍)和gi|79475768(3.377倍)。6個基因在高油酸油菜葉片中上調表達，表明在此時期高油酸油菜的光合作用能力強于低油酸油菜。

表1 與光合作用相關蛋白對應基因及其引物

圖1 與光合作用相關差異蛋白對應基因在出苗后7 d材料中的表達情況Fig.1 Expression of photosynthesis-related differential proteins corresponding genes in 7-day seedlings

圖2 與光合作用相關差異蛋白對應基因在5～6葉期不同材料葉片中表達Fig.2 Expression of photosynthesis-related differential proteins corresponding genes in 5-6 leaf stage leaves

2.3 越冬期葉片中基因表達情況

由圖3所示，gi|515616在低油酸油菜葉片中不表達，gi|79475768(3.607倍)、gi|312282567(3.198倍)和gi|50313237(1.245倍)在高油酸油菜葉片中下調表達，其余的基因在高油酸油菜中上調表達，其中gi|42571703(36.350倍)、gi|312282897(27.511倍)、gi|6006279(10.375倍)和gi|297853098(3.198倍)差別較大。5個基因在高油酸油菜葉片中上調表達，表明在此時期高油酸油菜的光合作用能力強于低油酸油菜。

2.4 花中基因表達情況

如圖4所示，gi|42571703(84.0倍)，gi|312282897(8.081倍)在高油酸油菜花中上調表達，gi|515616在2種油菜花中均不表達，其余的基因在高油酸油菜花中下調表達，其中gi|297853098(25.714倍)和gi|312282567(14.944倍)差別較大， 其次是gi|79475768(5.239倍)、gi|50313237(3.949倍)和gi|297825149(2.309倍)。6個基因在高油酸油菜花中下調表達，表明在花中高油酸油菜的光合作用能力低于低油酸油菜，也可能與采用的材料有關，光合作用主要發生在葉片中。

圖3 與光合作用相關差異蛋白對應基因在不同材料越冬期葉片中表達Fig.3 Expression of photosynthesis-related differential proteins corresponding genes in overwintering period leaves

圖4 與光合作用相關差異蛋白對應基因在不同材料花中的表達Fig.4 Expression of photosynthesis-related differential proteins corresponding genes in flowers

2.5 授粉后20～35 d種子中基因表達情況

如圖5所示，gi|515616在高油酸油菜授粉后20～35 d種子中不表達，gi|42571703(261.333倍)、gi|312282897(78.40倍)、gi|6006279(30.745倍)和gi|297825149(6.426倍)在高油酸油菜授粉后20～35 d種子中下調表達，gi|312282567(6.144倍)、gi|79475768(2.953倍)、gi|297853098(2.716倍)和gi|50313237(1.807倍)在高油酸油菜授粉后20～35 d種子中上調表達。

2.6 授粉后20～35 d角果皮中基因表達

從圖6可看出，gi|515616在低油酸油菜角果皮中不表達，gi|297825149(1.150倍)在高油酸油菜角果皮中上調表達，其余基因在高油酸油菜角果皮中下調表達，其中僅gi|6006279(3.13倍)和gi|312282567(2.4倍)差別在2倍以上。7個基因在高油酸油菜角果皮中下調表達，表明在此時期高油酸油菜的光合能力低于低油酸油菜，成熟期產量形成的重要時期，光合作用能力低可能是導致高油酸油菜與普通油菜產量存在一定差異的原因。

圖5 與光合作用相關差異蛋白對應基因在授粉后20～35 d種子中的表達Fig.5 Expression of photosynthesis-related differential proteins corresponding genes in 20-35 day seeds after pollination

圖6 與光合作用相關差異蛋白對應基因在授粉后20～35 d角果皮中的表達Fig.6 Expression of photosynthesis-related differential proteins corresponding genes in 20-35 day pod skin after pollination

3 討 論

由于基因表達的條件和表達的程度則隨時間、地點和環境條件而不同, 因而一個基因可以表達的蛋白質數目可能遠大于一[4]。在本研究中，gi|312282897和gi|312282567為蕪菁甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因，表達的蛋白質有2個；而甘藍型油菜正捕光色素蛋白復合物II類型III葉綠素a-b結合蛋白在授粉后20～35 d的種子中存在，而gi|515616基因在授粉后20～35 d的種子中不表達，可能是由于其它基因的表達產物隨時間、地點和環境條件發生改變或經過翻譯后修飾和剪接，產生改變形成該蛋白質，與甘藍型油菜正捕光色素蛋白復合物II類型III葉綠素a-b結合蛋白對應基因并非是導致該蛋白質表達的基因，因而在該時期種子中沒有表達。

在本研究中，發現gi|515616基因在不同生育期的表達情況不同，可以此作為某個時期油菜高油酸材料篩選的指示基因，根據其是否表達來初步判斷該材料是否為需要的高油酸材料。同時，gi|297825149基因(高油酸油菜角果皮中是唯一上調表達基因)和gi|312282897基因(高油酸油菜出苗后7 d去根材料中為唯一上調表達基因)也可作為某個時期選擇育種材料的基因；另外，gi|312282567基因、gi|50313237基因和gi|79475768基因及gi|297853098基因和gi|297825149基因有相同的表達規律，這些基因的表達規律均可用于高油酸油菜育種材料早期篩選研究，減少大量繁瑣的田間工作，加快育種進程。

Guan等[19]采用基因芯片技術對甘藍型油菜高油酸(71.71 %)和低油酸(55.6 %)材料進行分析發現，丙酮酸激酶為重要差異表達基因，且在高油酸材料中上調表達。這與本研究發現的該蛋白對應基因gi|79475768在授粉后20～35 d表達情況一致。丙酮酸激酶催化磷酸烯醇式丙酮酸生成ATP和丙酮酸, 控制著丙酮酸的外流量。因此，丙酮酸激酶的基因上調, 將影響整個脂肪酸代謝過程[19]。

4 結 論

利用高油酸油菜近等基因系材料，對iTRAQ分析得到的9個與光合作用相關差異蛋白對應基因在不同生育期表達規律進行研究。

(1)gi|515616基因在不同生育期表達情況不同，在高油酸油菜出苗后7 d去根材料中不表達，低油酸油菜5～6葉期、越冬期葉片和授粉后20～35 d角果皮中不表達，在花中、授粉后20～35 d種子中均不表達。gi|312282897基因在高油酸油菜出苗后7 d去根材料、越冬期葉片和花中上調表達，其中在高油酸油菜出苗后7 d去根材料為唯一上調表達基因，在高油酸油菜5～6葉期葉片、授粉后20～35 d種子和角果皮中下調表達。gi|297853098基因和gi|297825149基因在高油酸油菜出苗后7 d去根材料、5～6葉期葉片、花和授粉后20～35 d角果皮中下調表達，越冬期葉片和授粉后20～35 d種子中上調表達，其中gi|297825149基因在高油酸油菜角果皮中是唯一上調表達基因。gi|6006279基因在高油酸油菜出苗后7 d去根材料、花、授粉后20～35 d種子和角果皮中下調表達，5～6葉期和越冬期葉片中上調表達。gi|42571703基因在高油酸油菜出苗后7 d去根材料、授粉后20～35 d種子和角果皮中下調表達，5～6葉期和越冬期葉片及花中上調表達。gi|312282567基因、gi|50313237基因和gi|79475768基因在高油酸油菜出苗后7 d去根材料、越冬期葉片、花和授粉后20～35 d角果皮中下調表達，5～6葉期葉片和授粉后20～35 d種子中上調表達。

(2)在出苗后7 d材料中，有7個基因在高油酸油菜中下調表達；在花中，有6個基因在高油酸油菜花中下調表達；授粉后20～35 d角果皮中，有7個基因在高油酸油菜材料中下調表達；表明在出苗后7 d、花期和授粉后20～35 d高油酸油菜的光合作用能力低于低油酸油菜。5～6葉期葉片中，6個基因在高油酸油菜中上調表達；越冬期葉片中5個基因在高油酸油菜中上調表達；表明在5～6葉期、越冬期高油酸油菜的光合作用能力高于低油酸油菜。

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(責任編輯 陳 虹)

Expression Patterns of Genes according to Photosynthesis-relatedDifferential Proteins in High Oleic Acid Rapeseed Isogenic Lines

WANG Xiao-dan, XIAO Gang, ZHANG Zhen-qian*, GUAN Chun-yun, CHEN She-yuan, WU Xian-meng, ZHANG Shi-yuan

(College of Agriculture, Hunan Agricultural University/Southern Regional Collaborative Innovation Center for Grain and Oil Crops in China, Hunan Changsha 410128, China)

【Objective】In this paper, the relationship between gene expression and protein expression in photosynthesis were discovered so that the process of high oleic acid rape breeding could be accelerated. 【Method】The 7 days after emergence, 5-6 leaf stage, leaves of wintering period, petals, seeds and pods skins 20-35 days after pollination of high oleic acid rapeseed isogenic lines were used as tested materials to find out the expression rules in different development periods. The nine corresponding genes of the differential proteins which derived from the iTRAQ analysis were studied by Real-time quantitative PCR.【Result】In the development of 7 days after emergence, flowering and pollination 20-35 days, high oleic acid rapeseed had lower photosynthesis ability than low oleic acid rapeseed, while in the stages of 5-6 leaf and over-wintering, high oleic acid rapeseed had higher photosynthesis ability than low oleic acid rapeseed. Gi|515616 gene did not exist in high oleic acid rape of 7 days after emergence, the leaves of 5-6 leaf stage and over-wintering stage, pod skins 20-35 days after pollination of low oleic acid rapeseed, flower and seed 20-35 days after pollination of the two lines. The genes of gi|297853098, gi|297825149 and gi|312282567 had the same expression rules, while gi|50313237 and gi|79475768 had the same expression rules too. Gi|297825149 and gi|312282897 were the only up-regulated gene in pods skins and 7 days after emergence of high oleic acid rapeseed respectively.【Conclusion】These genes could be used as reference genes to screen high oleic acid rapeseed breeding materials, which would be useful to speed up the breeding process.

Real-time quantitative PCR；Photosynthesis；High oleic acid rapeseed

1001-4829(2017)7-1483-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.7.003

2016-07-23

國家自然科學基金“基于蛋白組學的油菜高油酸關鍵基因鑒定研究”(31201240)；國家973計劃“主要環境因子及生育期影響油菜油脂積累的分子基礎”(2015CB150206)；國家科技支撐計劃“油菜商業化育種研究與模式示范”(2014BAD01B07)；湖南省科技重大專項“高油酸油菜產業化發展關鍵技術研究與示范”(2014FJ1006)；作物種質創新與資源利用國家重點實驗室培育基地開放課題“與脂肪酸合成相關基因表達量研究及其功能驗證”；湖南農業大學作物學開放基金“高油酸油菜近等基因系差異基因研究”(ZWKF201302)

王曉丹(1992-)，女，河南鄭州人，在讀研究生，從事油菜育種研究，Tel：13838378556，E-mail：13838378556@139.com；*為通訊作者：張振乾(1977-)，男，河南南陽人，副教授，博士，從事油菜育種研究，Tel：15974175419，E-mail：zzq770204@163.com。

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