甘蔗與河八王雜交F1對黑穗病的抗性鑒定與初步評價

段維興，黃玉新，周 珊，張保青，高軼靜，楊翠芳，劉昔輝，張革民

(廣西農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所/廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室/中國農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究中心/農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術與遺傳改良重點實驗室，廣西 南寧 530007)

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甘蔗與河八王雜交F1對黑穗病的抗性鑒定與初步評價

段維興，黃玉新，周 珊，張保青，高軼靜，楊翠芳，劉昔輝，張革民*

(廣西農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所/廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室/中國農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究中心/農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術與遺傳改良重點實驗室，廣西 南寧 530007)

【目的】探明甘蔗與河八王雜交F1品系對黑穗病的抗性水平，為篩選河八王親本進行抗黑穗病育種提供理論依據(jù)。【方法】以廣西蔗區(qū)甘蔗黑穗病混合孢子粉為接種源，采用人工浸漬接種與自然感病相結合的發(fā)法，對甘蔗與河八王雜交F1與對照品種(系)共18個材料進行黑穗病抗性鑒定。通過潛伏期、接種發(fā)病率、自然發(fā)病率，結合標準對照種的抗性表現(xiàn)，評價參試品系的抗性，并采用系統(tǒng)聚類分析驗證。【結果】抗性水平為高抗(HR)的品系有SNF110-6-11、SNF110-6-22、SNF110-6-23，占16.67 %；抗(R)品系有SNF110-6-13、SNF110-6-14、SNF110-6-17、SNF110-6-20，占22.22 %；中抗(MR)品系有F134、SNF110-6-12、SNF110-6-15，占16.67 %；中感(MS)品系有NCo310、NCo376、SNF110-6-21，占16.67 %；感(S)品系有Ya71-374、ROC22、SNF110-6-18，占16.7 %。【結論】甘蔗與河八王雜交F1品系對黑穗病的抗性較高，可作為甘蔗抗黑穗病育種親本材料。

甘蔗；河八王；雜交F1；黑穗病；抗性鑒定；聚類分析

【研究意義】近年來，由于甘蔗黑穗病生理小種的變化，高抗品種抗性喪失，淪為感病品種[1]。甘蔗品種新臺糖22在我國蔗區(qū)約占60 %的種植面積，目前因高感黑穗病，經(jīng)濟損失大，急需優(yōu)良抗病新品種更新?lián)Q代[2]。河八王[Narengaporphyrocoma(Hance) Bor.]又名草鞋密，是重要的甘蔗近緣屬野生種質(zhì)，具有分蘗力強、抗黑穗病、抗赤腐病、抗花葉病等優(yōu)良性狀[3]，甘蔗與河八王在自然條件下很難雜交，廣西農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所通過收集河八王花粉進行低溫冷藏的方式獲得一批SNF1材料。因此，研究甘蔗與河八王雜交F1材料的抗性對甘蔗篩選優(yōu)良抗黑穗病親本，加快抗病品種選育與推廣均具有重要的意義。【前人研究進展】諸葛鎣等[4]研究認為，甘蔗與河八王雜交F1植株較高、分蘗少、莖徑硬度大且葉鞘毛多。黃家雍等[5]研究認為，甘蔗與河八王雜交F1比母本甘蔗具有更多的分蘗和旺盛的生活力，抗黑穗病、抗旱耐瘠性和宿根性強等野生特性。近年來，劉昔輝等[6-7]利用SSR標記對甘蔗與廣西河八王雜種F1后代進行真實性鑒定；并通過AFLP標記結合毛細管電泳對15份廣西河八王無性系進行遺傳多樣性分析及分子身份證構建。羅霆等[8]利用15N 自然豐度法分析甘蔗及近緣屬野生種的固氮效率，結果表明河八王及其F1后代材料比甘蔗品種、斑茅、割手密以及斑割復合體與甘蔗雜交后代等表現(xiàn)出更高的固氮能力。這些研究表明，河八王的優(yōu)良性狀在甘蔗育種中具有潛在利用價值。【本研究切入點】目前有關河八王的研究主要是對材料的表型評價，針對黑穗病抗性鑒定的研究報道較少。【擬解決的關鍵問題】為鑒定SNF1材料對黑穗病的抗性，采用人工浸漬接種與自然發(fā)病率相結合的方法，對13個SNF1品系進行黑穗病抗性鑒定與評價，旨在從中篩選抗病材料，為進一步開展抗黑穗病甘蔗新品種選育提供優(yōu)良親本。

1 材料與方法

1.1 供試材料

甘蔗與河八王雜交F1材料13個，分別為SNF110-6-11、SNF110-6-12、SNF110-6-13、SNF110-6-14、SNF110-6-15、SNF110-6-16、SNF110-6-17、SNF110-6-18、SNF110-6-19、SNF110-6-20、SNF110-6-21、SNF110-6-22、SNF110-6-23，廣西蔗區(qū)主栽品種ROC22、黑穗病抗性鑒定標準對照種F134(感小種2，抗小種1)、NCo310(抗小種2，感小種1)、NCo376(高抗小種1和2)和Ya71-374(高感小種1和2)，合計18份材料，由廣西農(nóng)業(yè)科學院甘蔗種質(zhì)資源圃提供。

1.2 黑穗病孢子的采集與保存

于2015年8-9月，分別從廣西南寧市隆安縣丁當鎮(zhèn)、廣西農(nóng)業(yè)科學院甘蔗資源圃采集新鮮黑穗病鞭子，在室溫下自然風干5 d，用毛筆刮下鞭子上的孢子粉，混合均勻后裝入封口袋，保存在4 ℃冰箱中備用。

1.3 黑穗病菌活性檢測

取0.1 g甘蔗黑穗病混合孢子粉加入50 mL無菌蒸餾水，震蕩混勻，稀釋為20～30個孢子/視野(10×10)的懸浮液。經(jīng)1 %瓊脂+1 %蔗糖培養(yǎng)基在28 ℃、相對濕度80 % rh條件下，在恒溫箱中培養(yǎng)12 h后檢測孢子萌芽率(以芽管長度超過孢子直莖1/2為萌發(fā))，設置3個重復，觀察200個孢子計算萌芽率。孢子萌芽率(%)=[孢子萌發(fā)數(shù)/(孢子萌發(fā)數(shù)+未萌發(fā)孢子數(shù))]×100。

1.4 接種、種植與發(fā)病調(diào)查

1.4.1 采用浸漬法人工接種 將孢子粉與水按照2 g/L的比例配置菌液[9]，將種芽(每品種60 芽)置于菌液中浸泡30 min，取出放入大橡膠桶內(nèi)密封，溫度在26～30 ℃，經(jīng)過保濕催芽24 h后種植。

1.4.2 種植措施 接種材料于2016年3月15日種植于桶中，每桶種4個芽，5桶1個重復，每材料設3次重復，種植時每桶施60 g復合肥(N∶P∶K=15∶15∶15)。

1.4.3 調(diào)查內(nèi)容 種植后發(fā)現(xiàn)抽出黑穗病鞭子時開始第1次調(diào)查，以后每隔15 d調(diào)查1次，直至發(fā)病情況穩(wěn)定為止。每次調(diào)查發(fā)現(xiàn)病株時，記載后連根拔除，在調(diào)查結束時合計發(fā)病株數(shù)及總株數(shù)，計算發(fā)病率。

1.5 田間自然感黑穗病調(diào)查

將18個試驗材料種植在廣西農(nóng)業(yè)科學院甘蔗資源圃內(nèi)，每個材料20芽種植3 m，在發(fā)現(xiàn)抽出黑穗病鞭子時開始調(diào)查，每30 d調(diào)查1次，直至病情穩(wěn)定為止，調(diào)查18個參試材料黑穗病自然發(fā)病率。

1.6 甘蔗黑穗病抗性分級標準

黑穗病分級參照闕友雄等[10]采用1～9級分級標準進行抗性分級(表1)。

表1 甘蔗黑穗病抗性分級標準

表2 甘蔗黑穗病孢子萌發(fā)情況

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

使用DPS 7.05版軟件進行聚類分析，對發(fā)病率數(shù)據(jù)進行標準化轉(zhuǎn)換后，采用卡方距離χ2和離差平方和的方法對試驗材料進行聚類分析，評價試驗材料的抗病性。

2 結果與分析

2.1 黑穗病孢子的活性檢測

在顯微鏡下觀察采集的黑穗病孢子粉，可見近圓形、棕褐色休眠孢子(圖1)。在1 %瓊脂糖培養(yǎng)基上做萌芽試驗，平均萌芽率超過90.00 %(表2)，表明用于接種的黑穗病孢子粉活性好，達到接種試驗要求。

2.2 甘蔗黑穗病發(fā)病潛伏期

從病原菌侵入至出現(xiàn)病害癥狀的這段時間稱為病害發(fā)病潛伏期。病害發(fā)病潛伏期是評價寄主對入侵病原菌防御能力的一個指標[9]。由表3可知，供試的18份品系中，黑穗病發(fā)病的潛伏期為30～102 d。發(fā)病潛伏期30～60 d有8個品系，占44.44 %；發(fā)病潛伏期60～90 d有5個品系，占27.78 %；發(fā)病潛伏期大于90 d有2個品系，占11.11 %。這表明人工接種后，大多數(shù)品系的發(fā)病潛伏期為30～60 d。從表3可以看出，供試品系的黑穗病發(fā)病率在0～44.44 %，黑穗病發(fā)病率相對較低的品系，其潛伏期較長；反之，發(fā)病率較高的品系，其潛育期較短。

圖1 黑穗病孢子粉鏡檢圖片(100倍)Fig.1 Microscopic examination of sugarcane smut spores on LB medium(100 multiple)

2.3 甘蔗黑穗病田間自然發(fā)病率

由表3可知，在黑穗病田間自然發(fā)病率條件下，參試材料的黑穗病發(fā)病率比人工接種脅迫下黑穗病的發(fā)病率低。在田間自然感染條件下，參試材料的黑穗病發(fā)病率介于0～20.83 %，其中有10個材料未發(fā)病，全部為河八王F1品系，占55.56 %。田間自然感病條件下，發(fā)病率高于10 %的材料有ROC22、Ya71-374。

表3 甘蔗與河八王雜交F1對黑穗病的抗性鑒定結果

2.4 聚類分析

聚類分析結果表明，供試材料對黑穗病抗性表現(xiàn)具有豐富的多樣性(圖2)。除SNF110-6-11、SNF110-6-22、SNF110-6-23這3個材料未發(fā)病，自成1類，不參加聚類外，當閾值為0.98時，其余15個材料可分為4類。第I類，包含4個材料，分別為SNF110-6-13、SNF110-6-20、SNF110-6-14、SNF110-6-17，表現(xiàn)為潛育期長，發(fā)病率低，抗性水平高。第II類，包含4個材料，分別為F134、SNF110-6-15、SNF110-6-16、SNF110-6-19，表現(xiàn)為發(fā)病率低，但抗性水平比第I類低。第III類，包含4個材料，分別為NCo310、NCo376、SNF110-6-21、SNF110-6-12，表現(xiàn)為潛育期短，中度感病。第IV類，包含3個材料，分別為Ya71-374、SNF110-6-18、ROC22，表現(xiàn)為潛育期短，發(fā)病率高，抗性最差。

3 討 論

本試驗采用人工浸漬接種與田間自然感病相結合的方法，評價甘蔗與河八王雜交F1代對黑穗病的抗性水平。參試的13個河八王F1品系中對黑穗病抗性達高抗(HR)或抗(R)的占試驗總數(shù)的50 %，反應出河八王F1品系對黑穗病的抗性水平普遍較高。其中SNF110-6-11、SNF110-6-22、SNF110-6-23發(fā)病率為0，表現(xiàn)為高抗，可考慮選擇作為甘蔗黑穗病抗病育種的親本材料。一些材料人工接種發(fā)病率高，田間自然感病率并不高，如SNF110-6-18、SNF110-6-21人工接種鑒定為感和中感，田間自然感病率為6.67 %、3.57 %，按照抗性分級標準為抗病級別。主要原因是河八王SNF1品系是近年新選育的，種植次數(shù)少，黑穗病菌還未大量積累；相反，人工接種鑒定為感病的品種ROC22、Ya71-374，其田間自然感病率也高。主要原因是這些品種育成時間久，種植年份長，尤其是ROC22作為廣西主栽品種10多年，黑穗病菌大量積累，導致接種后發(fā)病率最高。這與王維贊[11]等研究結果一致。

圖2 甘蔗與河八王雜交F1對黑穗病抗性的聚類分析結果Fig.2 Cluster analysis of smut resistance in sugarcane×Narenga porphyrocoma (Hance) Bor. hybrid F1

浸漬接種與針刺接種[12]的方法相比，接種后的黑穗病發(fā)病率相對較低，但因其未破壞甘蔗植株及芽的形態(tài)學抗性，其黑穗病抗性鑒定結果比較接近田間黑穗病的實際發(fā)生情況，鑒定結果更具參考性。此外，本試驗設置4個標準對照種，通過供試材料與標準對照種有關抗性指標的聚類分析對鑒定材料做出評價，而不單依據(jù)發(fā)病率的多少來判斷，降低了因環(huán)境互作影響表型而誤判的風險。由于本試驗只對供試材料進行了1年新植蔗桶栽和田間的抗性鑒定，缺少對多年宿根蔗的試驗觀察，然而抗性等級與作物季和年份的相關顯著[13]，且甘蔗對黑穗病抗性遺傳是中度可重復[14]，所以試驗材料仍需多年多點鑒定，才能準確的評價材料抗性。

4 結 論

甘蔗與河八王雜交F1品系對黑穗病具有較強的抗性，其中SNF110-6-11、SNF110-6-22、SNF110-6-23表現(xiàn)為高抗；SNF110-6-13、SNF110-6-14、SNF110-6-16、SNF110-6-17、SNF110-6-19、SNF110-6-20表現(xiàn)為抗，這些材料可作為甘蔗抗黑穗病育種的親本進一步雜交利用。

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(責任編輯 溫國泉)

Preliminary Identification and Evaluation for Smut Resistance inSugarcane×Narengaporphyrocoma(Hance) Bor. Hybrid F1

DUAN Wei-xing，HUANG Yu-xin，ZHOU Shan，ZHANG Bao-qing，GAO Yi-jing，YANG Cui-fang，LIU Xi-hui，ZHANG Ge-min*

(Sugarcane Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences/Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement/Sugarcane Research Center, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement (Guangxi), Ministry of Agriculture, Guangxi Nanning 530007, China)

【Objective】Resistance level of Hybrid F1 which were cross-fertilized by Sugarcane andNarengaporphyrocoma(Hance) Bor. to smut disease was studied in ordet to provide reference for selecting the disease-resistant offsprings ofNarengaporphyrocoma(Hance) Bor. to develop smut-resistant breeds. 【Method】Mixed spores ofUstilagoscitamineaSydow collected in the main sugarcane-planting areas in Guangxi Province were used as an inoculum. Dipping inoculation was carried out on 18 sugarcane varieties or clones. Natural incidence of smut was also investigated. Latent infection period, incidence and natural infection rate were investigated to evaluate the resistance of tested materials to smut.【Result】SNF110-6-11, SNF110-6-22 and SNF110-6-23 were highly resistant to smut (HR), accounting for 16.67 %；SNF110-6-13, SNF110-6-14, SNF110-6-17 and SNF110-6-20 were of the resistance (R), accounting for 22.22 %；F134, SNF110-6-12 and SNF110-6-15 were of the middle resistance (MR), accounting for 16.67 %；NCo 310, NCo 376 and SNF110-6-21 were of the middle sensitivity to smut (MS), accounting for 16.67 %；Ya 71-374, ROC 22, and SNF110-6-18 were sensitive to smut (S), accounting for 16.67 %.【Conclusion】Sugarcane×Narengaporphyrocoma(Hance) Bor. hybrid F1were resistant to smut and could be used as smut resistant germplasm in sugarcane breeding.

Sugarcane；Narengaporphyrocoma(Hance) Bor.；Hybrid F1；Smut；Identification of resistance；Cluster analysis

1001-4829(2017)7-1560-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.7.016

2017-03-06

廣西科技計劃重點項目“含河八王血緣的甘蔗抗病新種質(zhì)創(chuàng)制及其分子細胞遺傳學基礎研究”(桂科AB16380157)；“斑割復合體利用適宜回交世代分子遺傳學基礎及多抗優(yōu)良親本創(chuàng)新”(桂科AB16380126)；廣西自然科學基金項目“河八王片段代換系構建及特異基因遺傳分析”(2014GXNSFBA118115)；廣西農(nóng)業(yè)科學院基本業(yè)務專項項目“甘蔗種質(zhì)資源的保存、更新繁殖與共享”(2015JM03)；“河八王優(yōu)異野生基因資源發(fā)掘利用”(2015JZ96)；“甘蔗優(yōu)異野生基因資源發(fā)掘利用”(2015YT04)

段維興(1984-)，男，山西臨汾人，碩士，助理研究員，主要從事甘蔗育種及種質(zhì)創(chuàng)新研究，*為通訊作者：張革民，E-mail：zhanggm68@gxaas.net。

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