桑粉虱種特異性引物篩選

柴建萍，江秀均，倪 婧，羅雁婕，白興榮

(云南省農業科學院蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101)

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桑粉虱種特異性引物篩選

柴建萍，江秀均，倪 婧，羅雁婕，白興榮*

(云南省農業科學院蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101)

【目的】桑粉虱Pealiusmori(Takahashi)與其他種類粉虱形態相似，識別困難。設計、篩選桑粉虱種特異性引物，為桑粉虱檢測和鑒定提供理論依據。【方法】DNAMAN軟件比較與桑粉虱同源性較高的國內外具有代表性的7種粉虱線粒體COⅠ基因序列，應用Primer 5.0軟件設計5對桑粉虱COⅠ基因特異性引物。將各對引物與不同種類粉虱成蟲基因組DNA模板進行PCR擴增，檢測目的條帶，篩選桑粉虱種的特異性引物。以桑粉虱的卵和幼蟲基因組DNA為模板，驗證所篩選出的桑粉虱種特異性引物的靈敏性。【結果】2對桑粉虱種特異性引物sfs1-1/sfs1-2、sfs5-1/sfs5-2對桑粉虱單頭成蟲基因組DNA的PCR擴增產物分別為450、300 bp，而對煙粉虱B型、溫室白粉虱無擴增效果。2對引物對桑粉虱DNA模板濃度最低檢測值分別為0.15 pg/μl 、0.15 ng/μl。引物sfs1-1/sfs1-2靈敏性較引物sfs5-1/sfs5-2高1000倍。2對引物對桑粉虱成蟲、幼蟲及卵粒的線粒體COⅠ基因皆具較好擴增能力?！窘Y論】引物sfs1-1/sfs1-2、sfs5-1/sfs5具桑粉虱種的特異性，引物sfs1-1/sfs1-2為桑粉虱檢測、鑒定的首選引物。

桑粉虱；線粒體COⅠ基因；種特異性引物；篩選

【研究意義】伴隨“東桑西移”，云南桑園面積擴大，桑粉虱在云南植桑區的暴發危害呈擴大趨勢。桑粉虱蟲體小，與其他種類粉虱形態相似，識別困難。建立快速將桑粉虱與其它種類粉虱區別開的檢測技術成為桑粉虱發生機制與防控研究的迫切需求?！厩叭搜芯窟M展】桑粉虱Pealiusmori(Takahashi)屬同翅目，粉虱科，是對中國農業生產存在較大威脅的6種重要粉虱類害蟲之一[1]。桑粉虱以幼蟲、成蟲刺吸危害，其分泌物導致桑園煤污病流行，造成桑葉品質及產量下降。粉虱類害蟲的形體微小，種內變異普遍存在，僅憑粉虱成蟲的外觀識別易造成種類鑒定混亂[2]。粉虱分類鑒定依據蛹殼特征而非成蟲特征[3]。桑粉虱蛹體長0.70～0.80 mm，黃褐色，橢圓形；成蟲體長0.70～0.80 mm，體淡黃、被有白粉[4]，外形與其它種類粉虱極為相似?；贒NA序列的分子標記技術可找出不同生物類群間根本的遺傳差異，彌補傳統形態分類方法的不足，較快進行物種鑒定[5]。線粒體COⅠ基因被建議作為鑒定所有動物的通用工具[6-7]，廣泛應用于粉虱、蚜蟲等多種昆蟲新物種鑒定[8-9]?！颈狙芯壳腥朦c】應用分子生物學技術，以桑粉虱線粒體COⅠ基因部分系列設計、篩選具有桑粉虱種特異性引物?！緮M解關鍵問題】借助于線粒體COⅠ分子標記將桑粉虱與其他種類粉虱區別開，建立桑粉虱快速分子檢測技術，為植桑區桑粉虱害蟲識別、危害監測及種群發生機制研究提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗蟲源

桑粉虱于2014年6月采自云南省農業科學院蠶桑蜜蜂研究所桑園，蟲態為成蟲、卵、幼蟲。煙粉虱樣本采自桑園周邊寄主植物薄荷(2012年5月)，-80 ℃保存的成蟲。溫室粉虱2012年5月采自大棚內寄主植物黃瓜，-80 ℃保存的成蟲。煙粉虱及溫室粉虱經過線粒體COⅠ分子標記鑒定為煙粉虱B型及溫室白粉虱[10]。

1.2 試驗儀器與試劑

XW-80A渦旋儀(上海精科實業有限公司)，MiniSpin小型離心機(eppendorf)，S1000 PCR擴增儀(BIO-RAD)，PowerPac Universal電泳系統(BIO-RAD)，GelDoc TM+XR紫外凝膠成像系統(BIO-RAD)。

DNA提取液[含50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、20 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 % SDS]，Tris-EDTA緩沖液[含10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、1 mmol/L EDTA(pH 8.0)]，蛋白酶K(Merck)、Easy Taq DNA Polymerase、2.5 mmol/L dNTPs 購至Trans(北京)公司，引物由Invitrogen(上海)公司合成，其他無機試劑為國產分析純。

1.3 供試粉虱DNA提取

粉虱DNA提取方法參照柴建萍等[10]，分別提取5頭桑粉虱、煙粉虱、溫室白粉虱基因組DNA。收集桑粉虱5個粒卵及5頭2齡幼蟲，進行桑粉虱卵、幼蟲基因提取。

1.4 桑粉虱特異性引物設計

根據柴建萍等[11]研究中桑粉虱Pealiusmori(登陸號 KP168713)測序結果，以及NCBI數據庫中與桑粉虱具同源性及代表性的煙粉虱Bemisiatabaci(登陸號 KF059959)、溫室白粉虱Trialeurodesvaporariorum(登陸號 HM185763)、螺旋粉虱Aleurodicusdispersus(登陸號 KC822648)、番荔枝褶粉虱Aleurotrachelusanonae(登陸號 HM150624)、番石榴黑棒粉虱Aleuroclavaguyavae(登陸號 JQ340179)、伯粉虱待定種MetabemisiaSP(登陸號 JQ340198)7種粉虱線粒體COⅠ基因堿基序列，應用CLUSTAL X 2.1、MEGA5軟件進行序列對比分析，Primer Premer 5.0設計可供篩選的桑粉虱特異性引物5對(表1)并進行評價。

1.5 PCR最佳反應條件確定

用5對引物分別對桑粉虱DNA進行梯度PCR擴增，檢測引物擴增的有效性，確定PCR擴增最佳反應條件。PCR擴增體系為25 μl，其中含10×buffer 2.5 μl，2.5 μmol/L dNTPs 1.9 μl，20 μmol/L上、下游引物各0.5 μl, 5 U/μlTaqDNA polymerase 0.2 μl，100 μg/mL DNA模板1.8 μl。反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性20 s，50～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min。取5 μl 擴增產物，加1 μl載樣緩沖液于1 %瓊脂糖凝膠樣品孔，100 V電壓、電泳15 min后，用紫外凝膠成像系統檢測電泳結果。

表1 供篩選的桑粉虱特異性引物

1.6 特異性引物篩選

分別以桑粉虱、煙粉虱B型、溫室白粉虱各5頭成蟲的DNA為模板，用5對引物進行PCR擴增，檢測得到目的條帶有無或差異，篩選出桑粉虱種特異性引物。擴增條件同1.5。

1.7 特異引物靈敏性檢測

以桑粉虱5頭幼蟲、5粒卵提取的基因組DNA為模板，用篩選得到的特異性引物進行PCR擴增，檢測引物對不同蟲態DNA擴增的有效性；將桑粉虱DNA模板濃度按100、10-1、10-2、10-3、10-4系列梯度稀釋，以特異性引物進行PCR擴增，檢測、比較引物靈敏性差異。PCR體系及反應條件同1.5。

2 結果與分析

2.1 PCR最佳反應條件

5對引物對桑粉虱DNA進行梯度PCR擴增后得到清晰、單一、大小分別為450、500、300、450、300 bp的目的條帶，與預期產物相符(圖1～2)。結合目的條帶特異性及試驗操作簡便性，選擇52 ℃為各引物PCR退火溫度。結果表明，PCR反應體系及條件可作為特異性引物篩選及其靈敏性檢測的最佳反應條件。

2.2 特異性引物篩選

5對引物對桑粉虱、煙粉虱B型、溫室白粉虱基因組DNA進行PCR擴增，電泳檢測結果表明引物sfs2-1/sfs2-2不能將桑粉虱與溫室白粉虱區別開。引物sfs3-1/sfs3-2對煙粉虱B型、溫室白粉虱有非特異性擴增。引物sfs4-1/sfs4-2對煙粉虱B型及溫室白粉虱具一定擴增能力，不能產生與桑粉虱明顯區別。鑒于以上3對引物不能簡單、清淅、直觀的將桑粉虱與其他兩種粉虱區別開，故作舍棄。引物sfs1-1/sfs1-2、sfs5-1/sfs5-2對桑粉虱基因組DNA可分別擴增出約450、300 bp目的條帶，而這兩對引物對煙粉虱B型及溫室白粉虱DNA未能擴增出目的條帶(圖3～4)。結果表明，引物sfs1-1/sfs1-2、sfs5-1/sfs5-2具桑粉虱種的特異性，可用于桑粉虱與煙粉虱B型、溫室白粉虱的區別鑒定。

2.3 特異引物靈敏性檢測

特異引物sfs1-1/sfs1-2、sfs5-1/sfs5-2對桑粉虱幼蟲及卵DNA可分別擴增出約450、300 bp目的條帶，說明兩對引物對桑粉虱卵、幼蟲、成蟲各蟲態具有良好擴增能力(圖5～6)。桑粉虱DNA模板經100、10-1、10-2、10-3、10-4系列梯度稀釋后分別得到1.5 ng/μl、0.15 ng/μl、15 pg/μl、1.5 pg/μl、0.15 pg/μl模板濃度，經過兩對引物PCR擴增、靈敏度檢測得出：sfs1-1/sfs1-2引物對4個濃度模板均可擴出450 bp目的條帶，其對模板濃度的最低檢測值為0.15 pg/μl；sfs5-1/sfs5-2引物對2個濃度模板可擴出300 bp目的條帶，其對模板濃度的最低檢測值為0.15 ng/μl。引物sfs1-1/sfs1-2的靈敏性高于引物sfs5-1/sfs5-2 近1000倍，為桑粉虱檢測、鑒定的優選引物(圖7～8)。

M：DNA 分子標記；1～6：引物sfs1-1/sfs1-2；7～12：引物sfs2-1/sfs2-1；13～19：引物sfs3-1/sfs3-1M: DNA marker; 1-6: Primer sfs1-1/sfs1-2; 7-12: Primer sfs2-1/sfs2-1; 13-19: Primer fs3-1/sfs3-1圖1 引物sfs1-1/sfs1-2、sfs2-1/sfs2-2、sfs3-1/sfs3-2對桑粉虱DNA梯度PCR電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of primers sfs1-1/sfs1-2,sfs2-1/sfs2-2,sfs3-1/sfs3-2 gradient PCR to the DNA of Pealius mori

M：DNA分子標記；1～6：引物sfs4-1/sfs4-2；7～12：引物sfs5-1/sfs5-2M: DNA marker; 1-6: Primer sfs4-1/sfs4-2; 7-12: Primer sfs5-1/sfs5-2圖2 引物sfs4-1/sfs4-2、sfs5-1/sfs5-2對桑粉虱DNA梯度PCR電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of primers sfs4-1/sfs4-2、sfs5-1/sfs5-2 gradient PCR to the DNA of Pealius mori

M：DNA分子標記；1～5：桑粉虱；6～10：煙粉虱；11～15：溫室白粉虱M: DNA marker; 1-5: Pealius mori; 6-10: Bemisia tabaci B; 11-15: Trialeurodes vaporariorum圖3 引物sfs1-1/sfs1-2特異性檢測電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of primer sfs1-1/sfs1-2 specificity detection

M：DNA分子標記；1～5：桑粉虱；6～10：煙粉虱；11～15：溫室白粉虱M: DNA marker; 1-5: Pealius mori; 6-10: Bemisia tabaci B; 11-15: Trialeurodes vaporariorum圖4 引物sfs5-1/sfs5-2種的特異性檢測電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of primer sfs5-1/sfs5-2 specificity detection

3 討 論

對于形態特征不穩定或多變異性的昆蟲，特別是近緣種的區別和疑難種的鑒定，以PCR擴增分子標記技術可解決傳統形態分類難以解決的難題且不受蟲態影響[11]。線粒體COⅠ基因序列已在煙粉虱生物型鑒定，煙粉虱生物型取代、變遷、分布等監測多個領域發揮重要作用[12-13]。基于線粒體COⅠ基因序列分析基礎上發展起來的種特異性鑒定技術，在擴增未知模板時可根據目標片段的有無將目標種類與其它種類鑒別開，被廣泛應用于粉蚧、實蠅、小蠹蟲等檢疫性害蟲的快速鑒定[14-16]。粉虱類害蟲的快速識別與鑒定是有效阻止其擴散危害及防控的重要前堤[17]。泰麗等[18]通過對煙粉虱多個隱種線粒體COⅠ序列限制性內切酶位點分析，篩選特定的內切酶，建立了利用線粒體COⅠ 的PCR-RFLP技術成功鑒定了國內9個煙粉虱隱種。姚晶等[19]選擇線粒體DNACOⅠ保守區域內單核苷酸多態性為靶標，應用TaqMan等位基因技術快速鑒定煙粉虱隱種MEAM1和MED。王金娜等[20]應用RAPD技術篩選出溫室白粉虱特異性片段，由此片段設計SCAR特異引物可將溫室白粉虱與其他種粉虱區別開，提高了溫室白粉虱檢測效率。入侵性螺旋粉虱、雙鉤巢粉虱，應用其mtCOⅠ基因種的特異性序列，設計各自特異性引物，通過PCR擴增、檢測，成功將該粉虱與其他種粉虱區別開，為口岸檢疫、害蟲檢測及監測提供了快速分子鑒定技術支持[21-22]。

M：DNA分子標記；1：桑粉虱幼蟲；2：桑粉虱卵M: NDA marker; 1: Larva of Pealius mori; 2: Egg of Pealius mori圖5 引物sfs1-1/sfs1-2對桑粉虱幼蟲、卵PCR擴增電泳圖Fig.5 Electrophoretogram of primer sfs1-1/sfs1-2 amplification to the larva and egg of Pealius mori

M：DNA分子標記；1：桑粉虱幼蟲；2：桑粉虱卵M: NDA marker; 1: Larva of Pealius mori; 2: Egg of Pealius mori圖6 引物sfs5-1/sfs5-2對桑粉虱幼蟲、卵PCR擴增電泳圖Fig.6 Electrophoretogram of primer sfs5-1/sfs5-2 amplification to the larva and egg of Pealius mori

M：DNA分子標記；1～5：模板濃度分別為1.5 ng/μl,0.15 ng/μl,15 pg/μl,1.5 pg/μl,0.15 pg/μlM: NDA marker; 1-5: Template concentration 1.5 ng/μl,0.15 ng/μl,15 pg/μl,1.5 pg/μl,0.15 pg/μl圖7 引物sfs1-1/sfs1-2對桑粉虱DNA靈敏性檢測電泳圖Fig.7 Sensitivity test electrophoretogram of prime sfs1-1/sfs1-2 to DNA of Pealius mori

M：DNA分子標記；1～5：模板濃度分別為1.5 ng/μl,0.15 ng/μl,15 pg/μl,1.5 pg/μl,0.15 pg/μlM: NDA marker; 1-5: Template concentration 1.5 ng/μl,0.15 ng/μl,15 pg/μl,1.5 pg/μl,0.15 pg/μl圖8 引物sfs5-1/sfs5-2對桑粉虱DNA靈敏性檢測電泳圖Fig.8 Sensitivity test electrophoretogram of prime sfs5-1/sfs5-2 to DNA of Pealius mori

桑粉虱分布于我國各植桑區，東南部、西南部省份為主要危害地區。劉曼等[23]通過系統調查得出，西南地區主要粉虱害蟲為桑粉虱、煙粉虱、溫室粉虱和黑刺粉虱，桑粉虱已對云南保山和四川攀枝花一帶造成嚴重危害。宋早芹等[24]應用環境掃描電鏡對山東、江蘇、安徽、黑龍江4省桑樹粉虱偽蛹進行超微結構觀察，鑒定了桑樹上有5種常見粉虱。Wang, et al[25]借助于環境掃描電鏡對中國16省份87個采集地桑樹粉虱偽蛹數字圖像進行分析，鑒定了我國桑樹上有10種7屬粉虱。柴建萍等[10]應用線粒體COⅠ分子標記技術對云南蒙自桑園及周邊寄主植物粉虱種群鑒定，結果表明蒙自桑園只發現桑粉虱1種粉虱害蟲危害。云南植桑區分布于金沙江流域、珠江流域、滇南、滇西等產業帶、海拔300～2200 m區域。針對云南省復雜多樣的地理與氣候環境下桑園粉虱的危害，建立科學、簡便、高效的桑粉虱快速檢測技術，對桑粉虱鑒定、桑粉虱種群遷移擴散監測及其防控機制研究等有重要的科學意義。

本研究通過對比桑粉虱及與其同源性較高，國內外代表性粉虱共7種粉虱線粒體COⅠ堿基序列，設計、篩選出sfs1-1/sfs1-2、sfs5-1/sfs5-1桑粉虱特異性引物2對并建立桑粉虱快速分子檢測技術。sfs1-1/sfs1-2、sfs5-1/sfs5-1對桑粉虱單頭成蟲、幼蟲、卵粒均具擴增能力，產生目的片段分別約為450、300 bp，可將桑粉虱與桑園周邊多發性的煙粉虱、溫室白粉虱區別開。篩選出的兩對引物對桑粉虱基因組DNA模板最低檢測值為0.15 pg/μl 、0.15 ng/μl，皆可用于痕量或可疑蟲態的桑粉虱檢測。其中，引物sfs1-1/sfs1-2靈敏性是引物sfs5-1/sfs5-1的1000倍，為桑粉虱檢測、鑒定首選引物。由于受粉虱種類樣本限制，本試驗檢測驗證樣本僅涉及桑粉虱及廣泛分布危害的煙粉虱B型、溫室白粉虱，桑粉虱種特異引物驗證還需更多地域、更多種類粉虱樣本進行檢測證明。

4 結 論

引物sfs1-1/sfs1-2、sfs5-1/sfs5-1對桑粉虱單頭成蟲、幼蟲、卵粒均具擴增能力，為桑粉虱種特異性引物，可用于桑粉虱檢測與鑒定。由于引物sfs1-1/sfs1-2靈敏性更高，可作為桑粉虱檢測、鑒定首選引物。

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(責任編輯 王家銀)

Screening of Species Specific Primiers forPealiusmori

CHAI Jian-ping, JIANG Xiu-jun, NI Jing, LUO Yan-jie, BAI Xing-rong*

(Sericulture and Apiculture Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Yunnan Mengzi 661101, China)

【Objective】As it is difficult to identifyP.moriwith naked eye, the specific primer ofPealiusmori(Takahashi) was designed and selected to provide theortical basis for its detection and identification from similar whitefly. 【Method】The representative mitochondrialCOⅠ gene sequences of 7 species whitefly in the domestic and foreign homology withP.moriwere compared by using DNAMAN software, and five pairs of specific primers forCOⅠ gene ofP.moriwere designed by using Primer 5.0 software. PCR primers were used to amplify different kinds of whitefly adults DNA with five pairs primer, and the specific bands were selected to screen the specific primers. Using the egg and larvae DNA genome as the template, the sensitivity of the selected primers were verified.【Result】The amplification fragments of the 2 pairs specific primers sfs1-1/sfs1-2，sfs5-1/sfs5-2 to single adult genome DNA ofP.moriwere 450 bp, 300 bp, respectively. But it was no amplification effect toBemisiatabaciandTrialeurodesvaporariorum. The minimum detection value ofP.moriDNA template for the 2 pairs specific primer were 0.15 pg/μl, 0.15 ng/μl, respectively, and the sensitivity of primer sfs1-1/sfs1-2 was 1000 times higher than that of sfs5-1/sfs5-2. The two pairs of primers had a good ability to amplify theCOⅠ gene of adult, larvae and eggs ofP.mori. 【Conclusion】Primers of sfs1-1/sfs1-2 and sfs5-1/sfs5 have the species specificity forP.mori., and primer of sfs1-1/sfs1-2 is the first choice for the detection and identification ofP.mori..

Pealiusmori; MitochondrialCOⅠ; Species specific primers; Screening

1001-4829(2017)7-1570-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.7.018

2015-08-01

云南省現代農業蠶桑產業技術體系項目(2013KJTX 006)；現代農業產業技術體系建設專項項目(CARS-22-SYZ27)

柴建萍(1970-)，女，學士，副研究員，E-mail: chaijp@163.com，*為通訊作者：白興榮，E-mail: bxrong3@163.com。

S888.739;S435.79

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