端粒酶mRNA轉染對于軟骨組織活性提高作用的研究

吳海濤

摘要：目的：研究端粒酶mRNA轉染對于軟骨組織活性的提高作用。方法：選用大鼠的軟骨組織細胞，采用電染法實現端粒酶mRNA轉染，從而進行對照研究。結果：轉染后，軟骨組織細胞端粒酶活性增強，具有較強生長能力。結論：端粒酶mRNA轉染對于軟骨組織活性提高具有積極作用，具有進一步研究的價值。

關鍵字：端粒酶；軟骨組織；電轉染；活性提高作用；mRNA

前言

軟骨組織在人體中廣泛存在于骨組織的末端，是人體骨骼的主要保護組織，可使骨骼之間避免摩擦及沖擊。軟骨組織是由膠原組織、少許細胞、以及60-80%的水份等成份所構成，成人的軟骨組織中并無神經和血管，因此軟骨組織受傷后自行修復能力較差，容易在各種損傷作用下產生軟骨組織損傷，進而導致各種軟骨組織疾病的發生。

軟骨組織損傷性疾病是臨床多發疾病，自青壯年至老年 均可發病，發病率較高，是引起勞動力致殘的原因之一。軟骨組織損傷性疾病的治療有保守治療及手術治療，但目前治療均不能從根本上去除病患。多種因素均可導致軟骨組織損傷性疾病的發生，如創傷、遺傳等。軟骨組織細胞在維持軟骨組織生理功能中發揮重要作用，在軟骨損傷疾病的發生發展中扮演著重要角色。軟骨組織細胞隨著年齡的增長，生物學功能逐漸減低。老年人群中軟骨組織損傷性疾病發病率非常高，這可能和老年患者軟骨組織細胞功能下降有關。目前已 有研究者探索軟骨損傷性疾病的細胞治療。

端粒是真核細胞染色體末端的一種特殊結構，由端 粒DNA和端粒蛋白質組成，其功能是完成染色體末端的 復制，防止染色體融合、重組和降解[1-2]。在大多數正常 體細胞，由于所謂的“末端復制問題”，端粒隨每次細胞分裂而縮短。當端粒縮短到臨界長度時，即會造成細胞 靜止或凋亡，稱之為細胞衰老。但在生殖細胞和腫瘤細 胞等永生化細胞中，一般通過一種細胞內反轉錄酶—— 端粒酶的作用，端粒的長度維持穩定[3]，因此保證了這些 細胞的無限分裂。

端粒酶有3個組成部分：端粒酶RNA、端粒酶相關蛋白和端粒酶催化亞基。端粒酶RNA是合成端粒的模板，也是相關蛋白的結合支架，人端粒酶反轉錄酶是含有7個 基元的轉錄酶，表現聚合酶活性，在無細胞的情況下將 端粒酶RNA和人端粒酶反轉錄酶混合在一起即可表現端 粒酶活性，而端粒酶相關蛋白與端粒長度調節和端粒酶活性無關[4]。由于端粒酶RNA在細胞中大量存在。因此，端粒酶活性主要由人端粒酶反轉錄酶決定。許多研究者 利用外源性人端粒酶反轉錄酶基因”[5-9]。

文章期望通過將外源性人端粒得多種細胞“永生化酶反轉錄酶基因介導入軟骨組織細胞中，從而增強軟骨組織細胞的生物學特性，延長其在體外的傳代時間及增殖能力，并保持細胞的細胞表型，即所謂的“永生化”。

材料與方法

設計：細胞學體外觀察實驗。

實驗材料：Wistar大鼠9只，雌雄不限，體質180-200g。實驗過程中對動物處置方法符合動物倫理學要求。

實驗方法：

1、軟骨細胞的分離純化和鑒定

無菌環境下分離其脛骨及股骨，去除周圍附著的軟組織，并將干骺端與骨連接處2 mm的組織剪下，修整為1 mm×1 mm× 1 mm小塊，放入D-Hanks液中漂洗，用吸管將其移至 離心管中，1 000 r/min離心8 min，棄去上清，用胰酶重懸細胞，37 ℃水浴箱中消化5 min，再次離心，棄上清，加入0.1% Ⅰ型膠原酶重懸細胞后移至培養瓶中消化過夜，將消化液過濾去掉未消化的組織塊，離心，去上清，D-Hanks液重懸細胞，將細胞接種至含體積分數為 10%胎牛血清的DMEM/F12培養液中培養，放入37 ℃，體積分數為5%CO2培養箱中。

洗細胞2次，離心去上清，加入磁珠Buffer溶液重懸，加入羊抗兔IgG免疫磁珠10μL孵育，離心去上清，用磁珠 Buffer溶液清洗細胞2次，加入磁珠Buffer溶液重懸，將細胞懸液緩緩滴入位于磁場中的分離柱內，待懸液緩緩通過分離柱后，用Buffer緩緩沖洗，將陰性細胞洗脫。移開磁場，用Buffer溶液快速沖洗分離柱，將FGFR-3陽性細胞洗脫，即為軟骨細胞。然后再次離心去上清，加入含體積分數為10%胎牛血清的DMEM/F12培養液重懸細胞，將細胞接種于培養瓶中，放入37 ℃，體積分數為5%CO2培養箱中培養。取部分做爬片，固定，用免疫組化法對其進行鑒定。

2、端粒酶反轉錄酶基因電轉染

培養24 h后取 對數生長期細胞，將其制成單細胞懸液，PBS沖洗，胰酶消化，離心，收集前軟骨干細胞，加入電穿孔緩沖液使其重懸，離心800×g，靜置5 min，清洗細胞3次，離 心，重懸于電轉液中，轉移至電擊杯，加入20 μg質粒 DNA，輕輕混勻，靜置于冰上30 min，以電壓350 V/cm，電容25 μF，時間常數T為0.9 ms的電轉化參數進行電穿孔。將轉染后的前軟骨干細胞在室溫中放置30 min，移入DMEM培養基中放入37 ℃，體積分數為5%CO2培養 箱中培養。以轉染空質粒為陰性對照序列組，對照組未進行轉染。

3、TRAP-ELISA法檢測軟骨細胞端粒酶活性

采用Telo TAGGG Telomerase PCR ELISA Kit試劑盒按 說明書測定軟骨細胞端粒酶活性，在Ep管中加入 2×105 細胞，在4 ℃條件下按照3 000×g標準離心10 min，去除上清，加入200 μL Solution 1，依據16 000×g標準 離心20 min，吸取1-3 μL上清于一新的Ep管中，加入 25 μL Solution 2；取3 μL細胞提取物于85 ℃滅活10 min 作為陰性對照；在各管中加入Solution 6 使總體積至 50 μL；將樣本進行擴增，整體反應溫度及時間為：25 ℃ 10 min →個循環94 ℃ 1 min→30（94 ℃30 s 30 s→50 ℃ →72 ℃；取 30 s）→72 ℃ 10 min PCR擴增產物5 μL進行 ELISA實驗，使用酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度值。

4、RT-PCR檢測端粒酶反轉錄酶mRNA的表達

按照Trizol試劑說明書中的具體步驟提取各組細胞的總RNA，以紫外分光光度計檢測樣品吸光度并計算純度及 濃度。根據反轉錄合成試劑盒說明書進行反轉錄，PCR反應條件：95 ℃-94 5 min ℃-55 30 s ℃-72 40 s℃ 30 s，36個循環，72 ℃延伸7 min。每一PCR反應重復 3次。

將所得PCR產物在4 ℃條件下進行瓊脂糖凝膠電 泳，在凝膠自動成像儀上拍照提取圖像。以β-actin作為 內參照。

5、CCK-8法檢測細胞生長情況

將各組細胞接種 在96孔板上，每孔100 μL，每組設3個平行孔，于37 ℃，體積分數為5%CO2細胞培養箱中培養48 h，棄掉細胞培 養液，加入CCK-8 10 μL，于培養箱溫育2 h，在酶標儀 上測定吸光度值。

6、生長曲線測定

將各組同一時期轉染前后的前 軟骨干細胞制成單細胞懸液，按每孔2.0×104 細胞密度 接種于24孔板，每組設置3個復孔，置于37 ℃、體積分 數為5%CO2孵箱培養。從培養的第2天起，每天同一時 間消化3個孔，進行精確計數，連續5 d后繪制各組細胞 的生長曲線。

結果

首先采用TRAP-ELISA檢測各組細胞端粒酶活性，結果顯示：與陰性對照序列 組和對照組相比，人端粒酶反轉錄酶轉染組細胞端粒 酶蛋白表達上調，陰性對照序列組和對照組細胞端粒 酶蛋白表達差異無顯著性意義（P > 0.05）。

轉染48 h后，與對照 組、陰性對照序列組相比較，人端粒酶反轉錄酶轉染組軟骨細胞的吸光度值顯著升高，差異有顯著性意義（P < 0.05）。與對照組、陰性對照 序列組相比較，人端粒酶反轉錄酶轉染組的S期細胞明 顯增多；與對照組、陰性對照序列組相比較，G1期細胞 在人端粒酶反轉錄酶轉染組明顯減少，差異有顯著性意 義（P < 0.05），M期細胞無明顯變化。

與對照組、陰性對照序列組比較，人端粒酶反轉錄酶轉染組軟骨細胞的增殖能力顯著增強，差異有顯著性意義（P<0.05）。

討論

軟骨組織疾病的成因主要由于軟骨組織在損傷后的修復能力缺失，因此可以將提高軟骨組織活性作為軟骨組織疾病的治療方向加以研究。端粒酶既能夠延長端粒的末端，使其壽命得以增長，又能夠維持其長度[10-11]正常人體細胞中不能檢測出端粒酶活性的表達[12-13]，其表達 的多少主要決定因素是人端粒酶反轉錄酶[14-16]。近年來的 研究發現，正常人體中人端粒酶反轉錄酶的表達受到抑 制，且其表達是調控人端粒酶活性的重要因素[17-19]。

人端粒酶反轉錄酶轉染 對其在軟骨細胞的表達有明顯促進作用，并且不影響 其他亞單位的表達，與有關研究結果一致[14-19]。在對照組、陰性對照序列組中，人端粒酶反轉錄酶 mRNA 表現為陰性，啟動子未被激活。在轉染組中前軟骨干細胞啟動子的 活性、mRNA表達處在較高水平[20-22]，使端粒酶活性增加，端粒長度得以保持，延緩衰老。同時該研究亦證實人端粒 酶反轉錄酶可以加速軟骨細胞的增殖，誘使其發生永生化，與以往相關文獻研究相符合[23-25]。

綜上所述，將人端粒酶反轉錄酶轉染軟骨細胞，可以明顯提高端粒酶活性，S 期細胞明顯增多。因此，可通過人端粒酶反轉錄酶轉染來促進軟骨細胞增殖，進而達到治療軟骨損傷的目的。

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