HPLC法測定大鼠血漿中奧拉西坦的濃度

任靜華 劉宏達 譚顯惠 馮會英

摘要：目的：建立大鼠血漿中奧拉西坦濃度的檢測方法。方法：取大鼠18只，禁食不禁水12小時，分別按200 mg·kg-1的劑量一次性灌胃奧拉西坦溶液，所有大鼠分別于給藥后0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12 h眼內眥取血0.5 mL。采用高效液相色譜法檢測其血藥濃度。色譜條件：色譜柱：Diamonsil RP C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：乙腈-水（3.2：96.8，V/V）；流速：0.8 mL·min-1；檢測波長：210 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL；內標：阿昔洛韋。結果：奧拉西坦保留時間為3.7 min，內標阿昔洛韋保留時間為7.4 min，標準曲線方程為Y=0.0217 X +0.1058（r=0.9992），其檢測濃度的線性范圍為2～100 μg·mL-1。最低定量限及最低檢測限分別為0.005μg·mL-1和0.001μg·mL-1。低、中、高三種濃度的方法回收率分別為（102.25±8.51）%，（96.29±2.76）%和（98.14±1.62）%，其RSD值分別為8.32%，2.87%和1.65%；日內精密度RSD值分別為13.03%，2.87%和1.65%；日間精密度RSD值分別為12.60%，5.42%和3.72%；奧拉西坦的血漿樣品40℃低溫避光存放5天或反復凍融3次性質穩定，血漿樣品處理后放置4 h對測定無影響。結論：本方法簡便、準確、靈敏度高、重現性好，非常適用于測定大鼠血漿中的奧拉西坦的含量。

關鍵詞：高效液相色譜法；奧拉西坦；血藥濃度；大鼠

奧拉西坦（oxiracetam），又名奧拉酰胺，腦復智，是一環GABA類促智藥。研究顯示，奧拉西坦可以改善記憶與智能障礙患者的記憶力和學習功能[1]，還能保護神經細胞，改善大腦物質和能量代謝。可用于老年性癡呆、多梗死性癡呆和用于神經癥、腦外傷、腦炎等引起的腦功能不全、記憶力障礙，為臨床廣泛應用的促智藥。

目前已經報道過的血清奧拉西坦濃度的測定方法，流動相配制大多比較繁瑣，血漿樣品處理復雜，成本較高[2-16]。本研究擬建立大鼠血漿中奧拉西坦濃度的HPLC測定方法，為奧拉西坦大鼠體內藥代動力學研究提供方法學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜系統，包括515泵、486紫外檢測器、Empower Application 操作平臺（美國Waters公司）；Diamonsil C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm，美國Waters公司）；冷凍離心機（GL-20G-Ⅱ，上海安亭科學儀器廠）；渦旋混合器（XW-80A，上海醫科大學儀器廠）。

1.2 試藥

奧拉西坦對照品（石藥集團中諾藥業（石家莊）有限公司，純度99.60%，批號128101207）；注射用奧拉西坦（石藥集團歐意藥業有限公司，批號262120318，規格1 g）；阿昔洛韋對照品（湖北易泰藥業有限公司，批號20080620 含量100.7%）；乙腈（色譜純，天津市康科德科技有限公司，批號111203）；

1.3 動物

健康雄性SD大鼠，清潔級，體重（300±10）g，由山西省動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK（晉）2009-0001。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil RP C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：乙腈-水（3.2：96.8，V/V）；流速：0.8 mL·min-1；檢測波長：210 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL；內標：阿昔洛韋。

2.2 血漿樣品處理

取冷凍血漿樣品室溫自然解凍，10000 r·min-1離心5 min，取上清液200 μL于帶塞離心管中，加入內標溶液（濃度100 μg·mL-1阿昔洛韋溶液）20 μL混勻，加乙腈300 μL沉淀蛋白，渦旋振蕩1 min，10000 r·min-1離心5 min，取上清液400 μL于離心管中，40 ℃水浴下氮氣流吹干，殘渣用100 μL流動相復溶，進樣。

2.3溶液的制備

奧拉西坦儲備液的配制：精密稱取奧拉西坦對照品約200 mg，置于100 mL量瓶中，蒸餾水稀釋定容，制備成濃度為2mg·mL-1的奧拉西坦儲備液，4℃保存待用。

奧拉西坦對照品溶液的配制：分別精密量取奧拉西坦儲備液12.5 mL，7.5 mL，5 mL，2.5 mL，1.25 mL，0.625 mL，0.25 mL于25 mL量瓶中，蒸餾水定容，得到濃度依次為1000，600，400，200，100，50，20 μg·mL-1的系列奧拉西坦對照品溶液。

內標溶液的配制：精密稱量阿昔洛韋約10 mg于50 mL量瓶中，蒸餾水溶解定容，配制成濃度約為200 μg·mL-1的儲備液。精密量取儲備液25 mL于50 mL量瓶中稀釋成濃度為100 μg·mL-1的內標溶液。

奧拉西坦灌胃液的配制：稱取注射用奧拉西坦2.0 g，用蒸餾水溶解，置于50 mL量瓶中，蒸餾水定容，制備成濃度為40 mg·mL-1的奧拉西坦溶液。

2.4專屬性試驗

取奧拉西坦對照品溶液直接進樣，另取空白血漿、內標阿昔洛韋，奧拉西坦血漿樣品分別按“2.2”項下處理并測定，記錄色譜圖。結果表明，在該色譜條件下，在選定色譜條件下，奧拉西坦峰、內標峰、血漿內源性雜質峰均分離良好，奧拉西坦保留時間為3.7 min，內標阿昔洛韋保留時間為7.4 min，結果見Fig. 1。

2.5 標準曲線

取冷凍空白血漿7份，室溫自然解凍，分別精密吸取180 μL，加入系列濃度的奧拉西坦對照品溶液20 μL混勻，使血漿中奧拉西坦的濃度依次為100，60，40，20，10，5，2 μg·mL-1。按照“2.2 血漿樣品處理”方法處理并測定。以測得的奧拉西坦峰面積與內標峰面積之比（Y）對血漿藥物濃度（C）進行線性回歸，得到標準曲線方程為Y=0.0217 X +0.1058（r=0.9992），奧拉西坦在2～100 μg·mL-1濃度范圍內具有良好的線性關系。。

2.6 最低定量限及最低檢測限

配制約1μg·mL-1的奧拉西坦對照品溶液，以倍比稀釋法稀釋后，直接注入色譜儀進行測定，直至S/N≥10，該進樣量即為最低定量限，S/N≥3，該進樣量為最低檢測限。該方法的最低定量限及最低檢測限分別為0.005μg·mL-1和0.001μg·mL-1。

2.7 方法回收率

取空白血漿15份，分為3組，每組5份，分別制備濃度為5 μg·mL-1，20 μg·mL-1，60 μg·mL-1的奧拉西坦模擬血漿樣品，按照“2.2 血漿樣品處理”方法進行處理并測定。根據標準曲線方程計算出低、中、高不同濃度的奧拉西坦的模擬血漿樣品的方法回收率分別為（102.25±8.51）%，（96.29±2.76）%和（98.14±1.62）%，其RSD值分別為8.32%，2.87%和1.65%。

2.8 精密度

2.8.1 日內精密度

取空白血漿15份，分為3組，每組5份，制備濃度分別為5 μg·mL-1，20 μg·mL-1，60 μg·mL-1的奧拉西坦模擬血漿樣品，按照“2.2 血漿樣品處理”方法在一日內進行處理并測定，計算出日內精密度。三種不同濃度的奧拉西坦的模擬血漿樣品的RSD值分別為13.03%，2.87%和1.65%。

2.8.2 日間精密度

取空白血漿15份，分為3組，每組5份，制備濃度分別為5 μg·mL-1，20 μg·mL-1，60 μg·mL-1的奧拉西坦模擬血漿樣品，按照“2.2 血漿樣品處理”方法，連續5天進行處理并測定，計算出日間精密度。三種不同濃度的奧拉西坦的模擬血漿樣品的RSD值分別為12.60%，5.42%和3.72%。

2.9 穩定性

2.9.1 室溫放置穩定性

取空白血漿5份，制備濃度為20 μg·mL-1的奧拉西坦模擬血漿樣品，按照“2.2 血漿樣品處理”方法進行處理后，分別于0，1，2，3，4 h進行測定。處理血漿樣品放置4 h的RSD值為1.09%，改實驗結果對測定無影響。

2.9.2低溫保存穩定性

取空白血漿6份，分為2組，每組3份，制備成濃度為20 μg·mL-1的奧拉西坦模擬血漿樣品。其中一組按照“2.2 血漿樣品處理”方法即刻進行處理并測定；另一組-40℃低溫避光存放5天后按照“2.2 血漿樣品處理”方法進行處理并測定。其RSD值分別為1.72%和2.62%。實驗結果表明奧拉西坦的血漿樣品在低溫存放5天不影響測定結果。

2.9.3 反復凍融穩定性

取空白血漿6份，分為2組，每組3份，制備成濃度為20 μg·mL-1的奧拉西坦模擬血漿樣品。其中一組按照按照“2.2 血漿樣品處理”方法即刻進行處理并測定；另一組反復凍融3次后按照“2.2 血漿樣品處理”方法進行處理并測定，其RSD值分別為0.58%和1.03%，結果表明奧拉西坦的血漿樣品經過反復凍融不影響測定結果。

3 討論

3.1 流動相的選擇：奧拉西坦在有機溶劑中分配系數很小，而在水中溶解性良好。進行反相HPLC分析時，最常采用甲醇作為流動相的主要組分。但它的紫外切點為205 nm，測定奧拉西坦時采用210 nm與之接近，故不宜以甲醇作為流動相，而選用乙腈作為流動相。本實驗參照文獻資料，調整流動相的比例，最終采用乙腈：水=3.2：96.8作為流動相，在該條件下，不僅能使奧拉西坦與血漿內源性物質有較好的分離，而且使奧拉西坦與內標均在10 min內出峰，縮短分析時間。

3.2 奧拉西坦消除半衰期約3個小時，約3小時達峰，整個采樣時間至少應持續到3～5個半衰期，或持續到血藥濃度為Cmax的1/10～1/20，因此設定采血時間分別為0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12 h，并進行預實驗，結果表明該取血時間能夠反映出奧拉西坦在大鼠體內的藥代動力學特點，并且大鼠的有較好的耐受性，能夠滿足實驗要求。

3.3 本實驗從臨床藥物檢測角度研究建立高效液相色譜法測定奧拉西坦在大鼠體內的分布濃度，通過對大鼠體內不同劑量給藥和檢測給藥后不同時間藥物的分布情況，取得了大量科學數據。為該藥的研究建立了簡便、準確的科學分析方法。

參考文獻：

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