響應(yīng)面法優(yōu)化鹿銜草多糖提取工藝及抗氧化活性研究

桑朦

摘要：目的：應(yīng)用Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化鹿銜草多糖提取工藝，并研究其抗氧化活性。方法：在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以多糖提取率（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，加水量（X1）、浸提時(shí)間（X2）和提取溫度（X3）為考察對(duì)象，利用星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法優(yōu)化鹿蹄草多糖提取工藝，觀察其對(duì)二苯基苦基苯肼自由基（·DPPH）的清除作用。結(jié)果：優(yōu)化后的最佳工藝為加水量24.9倍，提取時(shí)間146.5min，提取溫度100°C，最佳提取工藝下鹿銜草多糖提取率達(dá)3.57%±1.56%，5 mg/mL的濃度就對(duì)DPPH的抑制達(dá)到80%以上。結(jié)論：Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化鹿銜草多糖提取工藝方法可行，鹿銜草多糖有一定的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：多糖；鹿銜草；響應(yīng)面法；抗氧化

鹿銜草又名鹿蹄草，鹿壽草，是鹿蹄草科（Pyrolaceae）鹿蹄草屬（Pyrola）植物鹿蹄草（Pyrola calliantha H. Andres）或普通鹿蹄草（Pyrola decorate H. Andres）的干燥全草[1]。具有祛風(fēng)濕，強(qiáng)筋骨，止血，止咳。臨床上常用于風(fēng)濕痹痛，腎虛腰痛，腰膝無(wú)力，月經(jīng)過(guò)多，久咳勞嗽。現(xiàn)代藥理研究表明鹿銜草含黃酮類[2-3]、酚苷類[4]、醌類[5]、萜類[6]、多糖[7-9]等化學(xué)成分，具有抗菌、抗炎、對(duì)心血管系統(tǒng)作用、抗氧化[10-11]、抗腫瘤等多種藥理作用[12]。目前關(guān)于鹿銜草黃酮和多酚的抗氧化研究報(bào)道較多，隨著對(duì)多糖類成分抗氧化的研究日益增多，也有部分關(guān)于多糖提取的研究報(bào)道，但對(duì)鹿銜草抗氧化的研究還比較少，因而研究其提取工藝和抗氧化活性更加重要。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）是常用的一種由于提取工藝優(yōu)化的設(shè)計(jì)方法，在中藥提取工藝研究中廣泛使用[13]。之前已有應(yīng)用正交設(shè)計(jì)研究水提取、堿水提取和酶法提取結(jié)合醇沉法制備鹿銜草多糖的工藝研究[7-8]，因此我們選用水作為提取溶劑，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)法安排提取實(shí)驗(yàn)，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化鹿銜草多糖提取工藝并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為鹿銜草的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)和參考。

1 材料與儀器

鹿銜草藥材（購(gòu)于陜西太白縣）。D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究所），濃硫酸、苯酚、乙醇等均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為純化水。

Autoscience AS 5150A超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司），電熱式恒溫水浴鍋（江蘇金壇宏凱儀器廠），RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），LXJ-Ⅱ離心沉淀機(jī)（上海醫(yī)用分析儀器廠），ME104電子天平（梅特勒-托利多）。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹿銜草多糖的含量測(cè)定

2.1.1 供試品溶液的制備

稱取鹿銜草藥材約500g，置于圓底燒瓶中，加入5倍量石油醚（沸程30～60 °C），于40°C水浴回流浸提2h，過(guò)濾，殘?jiān)鼡]干石油醚；加10倍藥材量80%乙醇于80°C水浴回流2h，過(guò)濾，殘?jiān)?0倍量80%乙醇洗滌2次，過(guò)濾，殘?jiān)鼡]干乙醇，置于60°C恒溫干燥箱中干燥24h，備用。稱取干燥后鹿銜草殘?jiān)s10g，精密稱定，加水于一定溫度下回流提取一定時(shí)間，過(guò)濾，濾液置于250 mL 量瓶中，用水定容，即得。

2.1.2 線性關(guān)系考察

精密稱取105°C干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品30mg，置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，得對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密移取該儲(chǔ)備液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL 置于10 mL 具塞試管中，各加水至2. 0ml，搖勻，在冰水浴中緩緩滴加0. 2 % 蒽酮-硫酸溶液至刻度，混勻，放冷后置水浴中保溫1 0分鐘，取出，立即置冰水浴中冷卻10分鐘，取出，以相應(yīng)試劑為空白。照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在582nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A，以A為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得回歸方程A= 27.429C+0.132（R2 = 0. 9974），表明葡萄糖質(zhì)量濃度在3～18 mg·L-1 與A呈良好線性關(guān)系。

2.2 多糖提取率的測(cè)定

采用蒽酮-硫酸法測(cè)定。精密移取供試品溶液1.0 mL置于10 mL 具塞試管中，按2.1.2項(xiàng)下自“加水至2.0mL”起，依次顯色，測(cè)定A，計(jì)算多糖提取率。

多糖提取率（%）=多糖質(zhì)量/藥材質(zhì)量×100%

2.3 單因素試驗(yàn)考察

2.3.1加水量

精密稱取2.1.1項(xiàng)下干燥的鹿銜草藥材殘?jiān)s10g，共5份，分別加入5，10，15，20，25倍量水，于80°C水浴浸提120min，提取1次，趁熱過(guò)濾，濾液置于250 mL 量瓶中，用水定容，測(cè)定A，計(jì)算多糖提取率分別為1.21%，1.46%，1.97%，2.12%，2.14%，加水量在1∶20的時(shí)候多糖提取率已經(jīng)趨于飽和。

2.3.2提取時(shí)間

精密稱取2.1.1 項(xiàng)下干燥的鹿銜草藥材殘?jiān)?份，每份約10 g，分別加200mL水于80°C水浴浸提60，90，120，150，180min，提取1次，按2.3.1項(xiàng)下自“趁熱過(guò)濾”起開(kāi)始操作，結(jié)果多糖提取率分別為1.04%，1.47%，2.12%，2.43%，2.38%，可能是因?yàn)槎嗵墙?jīng)長(zhǎng)時(shí)間加熱后發(fā)生部分水解，而使其含量降低[14]，故選取浸提時(shí)間150min。

2.3.3提取溫度

精密稱取2.1.1項(xiàng)下干燥的鹿銜草藥材殘?jiān)?份，每份約10 g，分別加200mL水于60，70，80，90，100°C水浴浸提150min，提取1次，按2.3.1項(xiàng)下自“趁熱過(guò)濾”起開(kāi)始操作，結(jié)果多糖提取率分別為1.36%，1.75%，2.43%，2.76%，2.82%，提取溫度越高，多糖得率越高。

2.3.4提取次數(shù)

精密稱取2.1.1項(xiàng)下干燥的鹿銜草藥材殘?jiān)?份，每份約10 g，加200 mL水于100°C分別提取1，2，3，4次，每次150min，按2.3.1項(xiàng)下自“趁熱過(guò)濾”起開(kāi)始操作，結(jié)果多糖提取率分別為2.82%，3.47%，3.63%，3.69%，第2次提取完成后基本多糖提取完全。

2.4 Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)選

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，由于提取次數(shù)為非連續(xù)變量，不能進(jìn)行回歸處理[15]，固定提取2次，分析因素表見(jiàn)表1，Box-Behnken效應(yīng)面法設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。選取加水量、提取時(shí)間、提取溫度為自變量，鹿銜草多糖提取率為因變量，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，分別用代碼-1，0，1，表示。

將表2 中數(shù)據(jù)運(yùn)用Design-Expert 8.05b 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，以多糖提取率（Y）為響應(yīng)值分別對(duì)各因素進(jìn)行多元線性回歸二項(xiàng)式方程擬合，擬合模型為Y=3.31+0.1X1+0.3X2+0.07X3-0.02X1X2-0.07X1X3-0.05X2X3-0.045X12-0.095X22-0.21X32（R2=0.9888；RAdj2=0.9744），對(duì)模型采用F檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析及模型系數(shù)顯著性檢查，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，溫度對(duì)鹿銜草多糖得率影響最大（P<0.0001），其次是加水量和提取時(shí)間。二項(xiàng)式模型P<0.0001，達(dá)極顯著水平，說(shuō)明該方程與實(shí)際情況擬合良好，模型的殘差可能是隨機(jī)誤差產(chǎn)生，可用此模型和方程來(lái)分析預(yù)測(cè)最佳提取工藝條件，多糖提取率與任意2個(gè)因素的三維效應(yīng)面曲線見(jiàn)圖6。以鹿銜草多糖提取率最大值為目標(biāo)，根據(jù)“Design Expert 8.05b”實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件得最佳鹿銜草多糖提取工藝參數(shù)為：加水量24.9倍，提取時(shí)間146.5min，提取溫度100°C，提取數(shù)2次，鹿銜草多糖提取率預(yù)測(cè)最大值3.55%。

2.5 提取工藝參數(shù)驗(yàn)證

按照星點(diǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化后的工藝參數(shù)提取3批鹿銜草多糖，多糖提取率結(jié)果見(jiàn)表4，平均提取率為13.74%±0.29%（n=3），驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)值與模型預(yù)測(cè)值偏差為0.02%，可知，實(shí)驗(yàn)觀察值和模型預(yù)測(cè)值比較接近，說(shuō)明模型預(yù)測(cè)性良好。

2.6 鹿銜草多糖抗氧化研究

2.6.1 鹿銜草多糖對(duì)DPPH 自由基清除作用

按照文獻(xiàn)[16] 的方法測(cè)定鹿銜草多糖對(duì)DPPH 自由基清除作用，配置濃度為1.0×10-4 mol/L 的DPPH 乙醇溶液，取2 mL的DPPH 乙醇溶液和2 mL鹿銜草多糖溶液，置于具塞試管中，室溫30 min，以蒸餾水為空白調(diào)零于517 nm 測(cè)定其吸光度為Ai；測(cè)定2 mL 濃度為1.0×10-4 mol/L的DPPH 溶液與2 mL 蒸餾水混合液的吸光度為A0；測(cè)定2 mL 多糖樣品溶液與2 mL 無(wú)水乙醇混合液的吸光度為Aj。按照下列公式計(jì)算清除率，根據(jù)不同濃度多糖溶液對(duì)DPPH 自由基的清除率作圖。以Vc作為陽(yáng)性對(duì)照。

DPPH 自由基抑制率=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%

2.6.2鹿銜草多糖抗氧化結(jié)果

鹿銜草多糖對(duì)DPPH 自由基有較為明顯的清除作用，并隨著多糖濃度的增加作用增強(qiáng)，且濃度達(dá)到5mg/mL時(shí)清除率達(dá)到80%以上。

3 討論

結(jié)果表明，通過(guò)Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化得到的鹿銜草多糖提取方法穩(wěn)定可行。溫度和加水量對(duì)多糖提取率有極顯著影響。其原因?yàn)楦邷貢?huì)增加藥物成分的運(yùn)動(dòng)交換，液料比的增加有利于多糖的溶解及擴(kuò)散，但過(guò)高的液料比不利于后期提取溶液的濃縮。

本試驗(yàn)通過(guò)用Box-Behnken效應(yīng)面法研究了加水量、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)鹿銜草多糖提取率相互作用的數(shù)學(xué)模型，并預(yù)測(cè)最佳提取工藝：鹿銜草加24.9倍水在100℃提取2次，每次146.5min，以此工藝條件得多糖提取率為3.57%，與預(yù)測(cè)值相符，說(shuō)明了用響應(yīng)面分析法來(lái)設(shè)計(jì)最佳提取工藝合理可行。

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