廣西人群Nogo基因rs2919126C/T和rs7575107G/T遺傳多態(tài)性研究

王 榮， 覃海媚，， 龐曉霞，， 楊鳳蓮， 韋貴將， 陳興鴻， 郭燦收， 王俊利

廣西人群Nogo基因rs2919126C/T和rs7575107G/T遺傳多態(tài)性研究

王 榮1， 覃海媚1，2， 龐曉霞1，2， 楊鳳蓮1， 韋貴將2， 陳興鴻2， 郭燦收3， 王俊利2

目的 研究廣西正常人群中軸索生長(zhǎng)抑制因子(Neurite growth inhibitor，Nogo) 基因rs2919126C/T位點(diǎn)和rs7575107G/T位點(diǎn)多態(tài)性分布特點(diǎn)，并分析其在不同人群中的分布差異。方法 采取多重單堿基延伸法(SNaPshot)與DNA測(cè)序法對(duì)323例廣西人群的Nogo基因rs2919126C/T位點(diǎn)和rs7575107G/T位點(diǎn)進(jìn)行基因分型檢測(cè)，并用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法比較其基因型和等位基因頻率在不同性別及組間分布差異。結(jié)果 rs2919126C/T存在CC、CT、TT 3種基因型，分布頻率為6.5%、33.4%、60.1%，此位點(diǎn)基因型及等位基因頻率在廣西人群的男女之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。其基因型和等位基因與國(guó)際人類(lèi)基因組單體型圖計(jì)劃(HapMap)公布的歐洲和非洲人群的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；rs7575107G/T存在GG、GT、TT 3種基因型，分布頻率為2.5%、24.8%、72.7%，此位點(diǎn)基因型及等位基因頻率在廣西人群的男女之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。基因型和等位基因頻率與非洲人群之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 Nogo基因rs2919126C/T位點(diǎn)和rs7575107G/T位點(diǎn)基因多態(tài)性在不同種族和地區(qū)間存在著不同程度差異。這種差異可能對(duì)研究在不同人群間Nogo基因多態(tài)性和疾病的相關(guān)性起到指導(dǎo)作用。

Nogo基因； 多態(tài)性； 種族

2000年，chen等首次分析從牛的脊髓中獲得的NI250同源物，繼而克隆出了Nogo基因[1]。Nogo基因經(jīng)不同的轉(zhuǎn)錄RNA可翻譯成三種異構(gòu)體，包括Nogo-A、Nogo-B及Nogo-C。Nogo蛋白在全身多處臟器和組織中表達(dá)，具有廣泛的生物學(xué)活性。現(xiàn)階段對(duì)Nogo蛋白的機(jī)制研究主要集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病領(lǐng)域。研究發(fā)現(xiàn)，Nogo-A在細(xì)胞遷移、軸突引導(dǎo)、膠質(zhì)細(xì)胞分化及髓磷脂的生成中，發(fā)揮著重要作用，具有維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)可塑性以及限制神經(jīng)過(guò)度生長(zhǎng)，從而起到維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)定的作用[2]。神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療和康復(fù)是一直困擾醫(yī)學(xué)界的難題。而基因多態(tài)性和疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但是，關(guān)于Nogo基因rs2919126C/T位點(diǎn)和rs7575107G/T位點(diǎn)遺傳多態(tài)性與疾病的研究，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。故我們采用SNaPshot法和DNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)這兩個(gè)位點(diǎn)的基因型，并探討其多態(tài)性在不同人群中的分布差異。這不僅能豐富不同地區(qū)人群Nogo基因的遺傳多態(tài)性數(shù)據(jù)，也可為進(jìn)一步研究其與疾病的發(fā)生及實(shí)施高危人群的防治提供基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 隨機(jī)選取右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院進(jìn)行體檢的323例體檢者，男性181例和女性142例，年齡17～76歲。排除肝、腎、心及神經(jīng)系統(tǒng)病史等疾病，臨床檢查和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)均正常。研究對(duì)象均來(lái)自廣西地區(qū)，研究對(duì)象相互間無(wú)血緣關(guān)系。研究方案在我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批后實(shí)施，且受試者均知情和簽署同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 樣本DNA制備 用含EDTAK2的抗凝采血管采集研究對(duì)象靜脈血3 ml，置于4 ℃冰箱保存。DNA提取試劑盒來(lái)自天根生化科技(北京)公司的血液基因組DNA提取試劑盒，采集標(biāo)本48 h內(nèi)，取200 μl樣本血液依照試劑說(shuō)明書(shū)抽提樣本DNA，置于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物合成 參考Nogo基因rs2919126C/T位點(diǎn)和rs7575107G/T位點(diǎn)的核苷酸序列，在Primer3.0在線引物設(shè)計(jì)軟件(http：//primer3.ut. ee/)設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)所需的特異性引物，委托上海生工合成。rs2919126C/T位點(diǎn)上游引物：5-ACAAGCATCTCTCCTCTCCCCTA-3，下游引物：5-GCCGCTTAAGATGGATGGTTTGT-3，延伸引物：5-ACAAGCATCTCTCCTCTCCCCTA-3；rs7575107G/T位點(diǎn)上游引物：5-GCTTCTGATTGGGATCATGGAAAG-3，下游引物：5-GCCACTTGCAAGACACCAGCTTA-3，延伸引物：5-GCCACTTGCAAGACACCAGCTTA-3 。

1.2.3 基因分型 PCR反應(yīng)體系為20 μl，包括：1.0 μl DNA、1xGC 緩沖液 (Takara Inc. )、 2.5 mM Mg2+、0.2 mM dNTP、0.2 μmol/L引物、1U HotStarTaq聚合酶 (Qiagen Inc. )。PCR反應(yīng)步驟：95 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，11個(gè)循環(huán)。94 ℃ 20 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共24個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)SAP酶及EXOI酶純化后進(jìn)行延伸反應(yīng)。延伸產(chǎn)物經(jīng)SAP酶純化后在ABI3730XL測(cè)序儀上樣，Polyphred軟件分析基因型結(jié)果。DNA測(cè)序驗(yàn)證SNaPshot法分型結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包分析數(shù)據(jù)。直接計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)各位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率。用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行各組基因多態(tài)性分布差異比較，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。哈迪溫伯格定律(Hardy-Weinberg)驗(yàn)證樣本人群是否有代表性。

2 結(jié) 果

2.1 rs2919126C/T和rs7575107G/T基因分型 經(jīng)檢驗(yàn)rs2919126C/T位點(diǎn)和rs7575107G/T位點(diǎn)的基因型分布符合Hardy-Weinberg定律(P=0.263；P=0.851，P均>0.05)，表明所選樣本人群具有代表性。rs2919126C/T位點(diǎn)和rs7575107G/T位點(diǎn)的擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為182 bp、320 bp。分型結(jié)果顯示，rs2919126C/T位點(diǎn)存在CC、CT、TT 3種基因型，頻率分別為6.5%、33.4%、60.1%；rs7575107G/T位點(diǎn)存在GG、GT、TT 3種基因型，頻率分別為2.5%、24.8%、72.7%。測(cè)序證和我們的分型結(jié)果相符合(見(jiàn)圖1、圖2)。

2.2 廣西人群中2位點(diǎn)的基因多態(tài)性分布 rs2919126C/T位點(diǎn)CC、CT、TT基因型及C、T等位基因頻率分布在男女兩組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。rs7575107G/T位點(diǎn)GG、GT、TT基因型及G、T等位基因頻率分布在男女間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表1、表2)。

2.3 各位點(diǎn)與其他種群的基因多態(tài)性比較 廣西人群rs2919126C/T位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率與歐洲人及非洲人相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與北京人和日本人相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；廣西人群rs7575107G/T位點(diǎn)基因型及等位基因分布頻率與非洲人之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與歐洲人、日本人及北京人相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表3、表4)。

①～③中箭頭分別指示CC、CT及TT基因型

①～③中箭頭分別指示GG、GT及TT基因型

性別例數(shù)基因型CCCTTTP等位基因CTP男女合計(jì)18114232312(6.6)9(6.3)21(6.5)67(37.0)41(28.9)108(33.4)102(56.4)92(64.8)194(60.1)0.28191(25.1)59(20.8)150(23.2)271(74.9)225(79.2)496(76.8)0.192

表2 廣西人群Nogo基因rs7575107G/T基因型及等位基因頻率在男女間比較[n(%)]

表3 Nogo基因rs2919126C/T位點(diǎn)基因型及等位基因頻率在不同人群間比較[n(%)]

表4 Nogo基因rs7575107G/T位點(diǎn)基因型及等位基因頻率在不同人群間比較[n(%)]

3 討 論

Nogo基因位于人類(lèi)第2號(hào)染色體短臂上(2p13-14)，長(zhǎng)度約75 kb，含有14個(gè)外顯子(長(zhǎng)度從47 bp至2400 bp)和8個(gè)內(nèi)含子(長(zhǎng)度從19 bp至37 kb)[3]。Nogo基因的轉(zhuǎn)錄受兩種啟動(dòng)子調(diào)控，其中啟動(dòng)子1(Promoter1，P1)負(fù)責(zé)啟動(dòng)Nogo-A/B的轉(zhuǎn)錄，而啟動(dòng)子2(Promoter2，P2)負(fù)責(zé)Nogo-C的轉(zhuǎn)錄。其中Nogo-A最長(zhǎng)，由1192個(gè)氨基酸殘基組成，主要通過(guò)與其受體NgR結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用，具有抑制中樞神經(jīng)軸突再生和參與腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程。Teng等[4]在一項(xiàng)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡實(shí)驗(yàn)中研究發(fā)現(xiàn)，Nogo-A蛋白可抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡，在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中起促進(jìn)作用。德國(guó)學(xué)者Kuhlmann等[4]發(fā)現(xiàn)，Nogo-A蛋白在少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)強(qiáng)度顯著高于星狀細(xì)胞瘤和室管膜細(xì)胞瘤，提出Nogo-A蛋白可以用來(lái)鑒別少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤與其他神經(jīng)膠質(zhì)瘤有效的新型標(biāo)志物。這提示Nogo蛋白與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病密切相關(guān)。楊峻峰等[5]檢測(cè)大鼠脊髓損傷后，Nogo-A在損傷早期一過(guò)性下降后呈高水平的表達(dá)，推測(cè)可能是造成脊髓損傷中樞系統(tǒng)再生困難的原因之一。目前，關(guān)于Nogo基因和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系的研究較少。袁微等[6]對(duì)202例缺血性腦卒中患者和199例健康者的病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，Nogo-A基因內(nèi)含子區(qū)的rs1012603C/T位點(diǎn)的多態(tài)性和缺血性腦卒中相關(guān)，T等位基因可能是缺血性腦卒中的易感基因。因此，正確分析和闡明Nogo基因多態(tài)性在不同人群中的分布特點(diǎn)，可為進(jìn)一步研究不同人群中Nogo基因多態(tài)性與疾病的發(fā)生發(fā)展間的關(guān)系提供分子遺傳學(xué)理論基礎(chǔ)。

單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)是指在基因組DNA序列中由單個(gè)堿基(A、G、C、T)替換而引起的多態(tài)性，是可遺傳變異中最常見(jiàn)的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上。rs2919126C/T和rs7575107G/T位于Nogo基因的內(nèi)含子區(qū)，內(nèi)含子的基因突變可以影響基因的轉(zhuǎn)錄效率，進(jìn)一步影響蛋白表達(dá)，從而參與疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[7，8]。我們的結(jié)果表明，廣西人群Nogo基因的rs2919126C/T和rs7575107G/T位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在不同性別間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明廣西人群中的這兩個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性與性別無(wú)關(guān)。進(jìn)一步將兩位點(diǎn)結(jié)果與HapMap公布的不同人群比較發(fā)現(xiàn)，廣西人群rs2919126C/T的基因型及等位基因頻率與歐洲人和非洲人比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而與北京人和日本人比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。廣西人群rs7575107G/T位點(diǎn)基因型及等位基因分布頻率與非洲人之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與歐洲人、日本人及北京人相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。引起這種多態(tài)性的原因與人種有關(guān)外，還可能受生活環(huán)境和自然選擇等因素影響[9]。結(jié)果說(shuō)明rs2919126C/T和rs7575107G/T位點(diǎn)多態(tài)性在不同人群中分布呈不同程度的差異。這種差異可能對(duì)今后研究Nogo基因多態(tài)性不同人群間同疾病的關(guān)系發(fā)揮指導(dǎo)意義。

近年來(lái)，隨著基因測(cè)序等技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)不同的遺傳背景表現(xiàn)出對(duì)疾病的易感性和預(yù)后質(zhì)量呈現(xiàn)出不同差異，提示研究基因多態(tài)性差異有助于了解疾病的不同患病特點(diǎn)。而我們首次開(kāi)展對(duì)廣西健康人群的Nogo基因rs2919126C/T位點(diǎn)rs7575107G/T位點(diǎn)多態(tài)性研究，并和人群進(jìn)行比較。一方面，可為Nogo基因遺傳學(xué)普查提供了資料。另一方面，為其相關(guān)疾病的研究奠定了基因水平上的基礎(chǔ)。我們的研究也存在不足，未分析更多人群進(jìn)行比較，結(jié)果僅具有區(qū)域代表性。因此，進(jìn)一步調(diào)查其多態(tài)性在我國(guó)其他人群中的分布和研究與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系是今后的探索方向。

[1]Chen MS，Huber AB，van der Haar ME，et al. Nogo-A is a myelin-associated neurite outgrowth inhibitor and an antigen for monoclonal antibody IN-1[J]. Nature，2000，403(6768)：434-439.

[2]Schmandke A，Schmandke A，Schwab ME. Nogo-A：Multiple Roles in CNS Development，Maintenance，and Disease[J]. Neuroscientist，2014，20(4)：372-386.

[3]Liu GM，Luo YG，Li J，et al. Knockdown of Nogo gene by short hairpin RNA interference promotes functional recovery of spinal cord injury in a rat model[J]. Mol Med Rep，2016，13(5)：4431-4436.

[4]Teng FY，Tang BL. Nogo/RTN4 isoforms and RTN3 expression protect SH-SY5Y cells against multiple death insults[J]. Mol Cell Biochem，2013，384(1/2)：7-19.

[5]楊俊鋒，張亞峰，馬 勇，等. Nogo-A在脊髓損傷大鼠脊髓組織中的動(dòng)態(tài)表達(dá)[J]. 中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2015，30(9)：867-871.

[6]袁 微，王耀輝，蒙蘭青，等. 神經(jīng)突起生長(zhǎng)抑制因子A基因多態(tài)性與缺血性腦卒中患者遺傳易感性的研究[J]. 中華老年心腦血管病雜志，2014，16(7)：682-685.

[7]Jo BS，Choi SS. Introns：The Functional Benefits of Introns in Genomes[J]. Genomics Inform，2015，13(4)：112-118.

[8]李文君，朱 可，趙冬雪，等. Fetuin-A基因多態(tài)性(rs4917，rs4918)與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的關(guān)系[J]. 中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2016，33(8)：719-723.

[9]柯金坤，姚宇峰，劉舒媛，等. 不同海拔高度低氧環(huán)境差異對(duì)EPAS1基因多態(tài)性的影響[J]. 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2011，28(5)：583-588.

A study on rs2919126C/T and rs7575107G/T polymorphism of Nogo gene in Guangxi population

WANGRong，QINHaimei，PANGXiaoxia，etal.

(YoujiangMedicalUniversityforNationalities，Baise533000，China)

Objective To investigate the distribution characteristic polymorphisms of Nogo gene rs2919126C/T and rs7575107G/T in Guangxi people and analyze the distribution difference in other ethnic groups. Methods The genotypes of rs2919126C/T and rs7575107G/T in Nogo gene were examined by using SNaPshot technique and DNA sequencing in 323 Guangxi people and analyzed the distribution frequencies of allele and genotype in different people and gender with statistical method. Results Three genotypes of CC，CT，and TT were found in rs9515962C/T site with the frequency distribution of 6.5%，33.4%，and 60.1%，respectively and genotype and allele frequency were not significantly different between different gender in the Guangxi population(P>0.05). Compared with the distribution frequencies of genotype and allele of HapMap-CEU and HapMap-YRI，there was significant difference (P<0.01). Three genotypes of GG，GT，and TT were found in rs7575107G/T with the frequency distribution of 2.5%，24.8%，and 72.7%，respectively and genotype and allele frequency were not significantly different between different gender in the Guangxi population(P>0.05). There was significant difference of genotype and allele distribution frequency between Guangxi population and HapMap-YRI(P<0.01). Conclusion rs2919126C/T and rs7575107G/T polymorphism of Nogo gene are different in diverse people. It might play a directive role in the study on association of Nogo gene polymorphisms and disease among different population.

Nogo gene； Polymorphism； Ethnic

1003-2754(2017)07-0584-04

2017-03-25；

2017-06-20

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 81560461)

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖遺傳實(shí)驗(yàn)室，廣西 百色 533000；3.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 百色 533000) 通訊作者：王俊利，E-mail：3310283225@qq.com

Q346

A