基因組學(xué)研究Csu基因簇在生物被膜生成過程中的作用

李海濤，張魯濤，李 帥，王伯麗，齊天杰，李宏林

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸內(nèi)一科，河北 石家莊 050000)

·論 著·

基因組學(xué)研究Csu基因簇在生物被膜生成過程中的作用

李海濤，張魯濤，李 帥，王伯麗，齊天杰，李宏林

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸內(nèi)一科，河北 石家莊 050000)

目的探討基因組學(xué)研究Csu基因簇在多藥耐藥鮑曼不動桿菌生物被膜生成過程中的作用。方法選取我院臨床檢驗科細菌室分離篩選的多重耐藥鮑曼不動桿菌菌株，取該菌株致病力最強的快速生長期和生物被膜期，提取2個不同時期的mRNA進行基因組比對研究。將樣本的基因序列與公共數(shù)據(jù)庫進行比較，進行功能注釋。結(jié)果同一菌株在菌體快速生長期和生物被膜期2種狀態(tài)下基因表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。生物被膜狀態(tài)的菌體較快速生長期的菌體有106個基因的表達上調(diào)，其中CsuA/B/C/D基因簇表達呈顯著升高，92個基因出現(xiàn)了表達的下調(diào)。結(jié)論CsuA/B/C/D基因簇在生物被膜生成和形態(tài)維持中發(fā)揮著極其重要的作用。細菌生物被膜形成過程中，菌體的初始黏附依賴于CsuA/B/C/D基因的顯著表達。CsuA/B/C/D基因簇介導(dǎo)菌毛的生物合成，還介導(dǎo)菌體分泌表面活性物質(zhì)和細胞外基質(zhì)，這些是生物被膜形成早期階段所必需的。

鮑氏不動桿菌；抗藥性，多藥；基因檢測

目前最具威脅的院內(nèi)感染致病菌包括屎腸球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和腸桿菌屬，這些超級細菌對目前大多數(shù)可用的抗生素均耐藥[1]。多藥耐藥的鮑曼不動桿菌目前已經(jīng)成為醫(yī)院院內(nèi)感染的重要病原菌，常常會引起廣泛的院內(nèi)感染[2-3]。鮑曼不動桿菌可以長期存活，造成慢性定植和感染的反復(fù)發(fā)生，主要是由于細菌菌體生物被膜的形成。本研究應(yīng)用高通量轉(zhuǎn)錄組基因測序方法，檢測相關(guān)調(diào)控因子在生物被膜生成中的影響，探討生物被膜獨特的生長方式以及細菌菌體長期定植造成反復(fù)感染的機制，報告如下。

1 資料與方法

1.1 收集和篩選菌株 菌株來自河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院臨床檢驗科細菌室，對收集的菌株進行篩選和藥敏檢測，剔除非鮑曼不動桿菌及非多藥耐藥菌株，收集多重耐藥鮑曼不動桿菌菌株。多重耐藥鮑曼不動桿菌是指對5類目前應(yīng)用的抗生素有3類或者3類以上耐藥。

1.2 樣本的制備 試驗菌株選取分離篩選的多重耐藥鮑曼不動桿菌菌株中數(shù)量最多的優(yōu)勢菌株Acinetobacter baumannii BJAB0868進行研究。取該菌株致病力最強的快速生長期和生物被膜期，提取2個不同時期的mRNA進行轉(zhuǎn)錄組基因比對研究。將多重耐藥Acinetobacter baumannii BJAB0868接種于無菌血培養(yǎng)皿生長8 h，酶標儀測定600 nm吸光度值(檢測OD600=0.4)，獲得快速生長期菌株。以無菌肉湯配制濃度為0.7 Mac的菌懸液，生長在50 mL微發(fā)酵罐中，持續(xù)在37 ℃恒溫?zé)o菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)96 h，使得生物被膜均勻生長在微發(fā)酵罐下層表面。每個微發(fā)酵罐加入1%結(jié)晶紫2 mL，染色30 min。再用PBS清洗3次，無菌環(huán)境中常溫風(fēng)干，再加入2 mL 95%的乙醇，脫色15 min，用酶標儀測定600 nm吸光度值。均值為空白對照的2倍以上者為生物膜形成陽性。然后電子顯微鏡鏡下觀察生物被膜生長情況。

1.3 樣本mRNA的提純和提取 選取多重耐藥Acinetobacter baumannii BJAB0868進行研究。取該菌株快速生長期和生物被膜期，提取2個不同時期的mRNA。應(yīng)用RNAprotect Bacteria Reagent和RNeasy Mini Kit試劑盒。取2個樣本的懸浮菌液，離心，收集菌體。用溶菌酶消化菌體，再加入裂解液，反復(fù)收集，提純，剔除菌體中DNA和蛋白質(zhì)。得到菌體總RNA，進一步提純mRNA。樣本RNA≥1 μg，應(yīng)用Life-tech Ribominus系列試劑盒提取。

1.4 樣本基因結(jié)果注釋 將樣本的基因序列與公共數(shù)據(jù)庫進行比較，通過基因的相似性進行功能注釋。基因相似性比對主要基于局部序列排比檢索基本工具(Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)算法。BLAST能夠?qū)崿F(xiàn)比較兩段核酸或者蛋白序列之間的相似性的功能。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用R version 3.3.0軟件處理數(shù)據(jù)， 組間基因表達的比較采用Fisher精確檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 樣本RNA數(shù)據(jù)的質(zhì)控檢測 對高通量測序所使用的mRNA數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評估：①污染評估，對比鮑曼不動桿菌公共數(shù)據(jù)庫，是否污染其他物質(zhì)RNA；②純度評估，結(jié)果樣本RNA純度高，可進行后續(xù)研究。樣本測序序列無明顯污染其他物種序列(圖1)，其中橫坐標表示測序位置，縱坐標為測序質(zhì)量值，圖中紅色表示中位數(shù)，黃色是25%～75%區(qū)間，觸須是10%～90%區(qū)間，藍線是平均數(shù)。測序是雙端測序，每條 read 長度 125 bp。隨著測序的進行，酶的活性會逐步下降，因此到達一定測序長度后，堿基質(zhì)量值也會隨之下降。中位值均在 Q20 以上，因此該文庫堿基質(zhì)量良好，可用于后續(xù)分析。

圖1 樣本堿基質(zhì)量分布圖

Figure 1 The sample base mass distribution

2.2 2組樣本基因表達比較 2種狀態(tài)的菌體有198個基因表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。生物被膜狀態(tài)的菌體有106個基因較快速生長期菌體的基因表達上調(diào)，其中又有53個基因表達呈顯著升高，但在快速生長期菌體的表達極少，甚至表達被完全抑制。此外，有92個基因出現(xiàn)了表達的下調(diào)(圖2)，CsuA/B/C/D基因表達是顯著升高的。見表1。

在圖2中，每一個點代表一個基因，橫縱坐標分別表示log2(FPKM)值。其中紅色表示上調(diào)基因，綠色表示下調(diào)基因，藍色表示表達的基因差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 基因表達量散點圖

Figure 2 The difference in basic table scattering amount scattering

表1 表達顯著升高的基因列表Table 1 The list of highly expressed genes

注：Fisher精確檢驗

3 討 論

生物被膜是細菌微生物的聚合體，它可以不可逆地黏附在醫(yī)療器械或者人體組織的表面，包埋入自身分泌產(chǎn)生的細胞外基質(zhì)中。主要包括細胞外多糖、蛋白質(zhì)、細胞外核酸以及其他基質(zhì)[4]。對于鮑曼不動桿菌來說，常常會形成難以清除的生物被膜，這是其慢性長期定植于人體組織和持續(xù)存在于各類患者體內(nèi)置管中的重要原因[5]。此外，生物被膜還與菌株多藥耐藥特性有關(guān)，生物被膜內(nèi)的菌體更耐不利的外環(huán)境和各種抗生素[6]。鮑曼不動桿菌對抗生素耐藥主要是由于菌體生物被膜的生成[7]。

生物被膜的生成，主要經(jīng)歷3個階段：初始黏附、細胞外基質(zhì)分泌結(jié)構(gòu)形成及生物被膜成熟[8]。此外，細菌生物被膜的形成需要復(fù)雜的信號因子調(diào)控以及多種蛋白參與其中[9]。生物被膜初始黏附，起始步驟就是需要黏附于一個生物或者非生物的表面，這是細菌侵犯機體造成感染的先決條件，也是細菌生物被膜形成的先決條件。細菌菌體的黏附主要靠蛋白和菌毛的介導(dǎo)，通過非特異電引力或者疏水作用促進細菌的黏附，此階段是可逆的黏附[10]。隨后，細菌分泌大量細胞外基質(zhì)及信號調(diào)控因子，促使細菌與黏附表面之間形成不可逆的牢固結(jié)合[11]。在隨后的生物被膜生長和形態(tài)維持過程中，信號因子的調(diào)控起著十分重要的作用，如群體感應(yīng)系統(tǒng)會感應(yīng)被膜內(nèi)細菌釋放的特定信號因子，這些信號因子及其特異的感應(yīng)受體在菌體內(nèi)部和菌落細菌之間進行信號交流，調(diào)控生物被膜菌落的基因和蛋白表達。在細菌啟動初始黏附階段，需要CsuA/B/C/D家族的顯著表達，幫助促進菌體的初始黏附。此外，這些基因還會作為特殊的信號系統(tǒng)，調(diào)控細菌生物被膜的生長和形態(tài)維持。目前，多藥耐藥鮑曼不動桿菌以生物被膜形式廣泛存在，難以清除；但是有關(guān)生物被膜形成能力與被膜維持所需相關(guān)基因調(diào)控仍不明確[12]。

細菌生物被膜的形成，使得菌體可以在不利的環(huán)境下長期存活，造成了鮑曼不動桿菌在人體組織慢性定植和感染反復(fù)發(fā)生。細菌的生物被膜狀態(tài)，不單單只是細菌在不同生長階段的簡單混合物，而是具有自己獨特蛋白質(zhì)表型和特殊的生物學(xué)特性。生物被膜的生成、形態(tài)維持是通過特殊通路和信號因子啟動以及復(fù)雜信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的。細菌從浮游狀態(tài)到生物被膜內(nèi)菌株固著狀態(tài)是一系列復(fù)雜的過程，需要啟動狀態(tài)轉(zhuǎn)換，形成足夠密度的菌落、適宜的陽離子濃度、特殊的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，啟動其轉(zhuǎn)換模式。但大多機制不明。

本研究結(jié)果顯示，生物被膜狀態(tài)下，CsuA/B/C/D基因表達是顯著升高的。說明其在生物被膜生成和形態(tài)維持中發(fā)揮著極其重要的作用。細菌生物被膜形成中，菌體的初始黏附需要依賴CsuA/B/C/D基因的顯著表達[13]。生物被膜在形成過程中，初始黏附以及隨后發(fā)生的基質(zhì)分泌、被膜逐漸成熟、形成不可逆黏附均需要復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，且這些基因表達需要時序性調(diào)控，其中CsuA/B/C/D基因會介導(dǎo)菌毛產(chǎn)生增加，幫助生物被膜黏附和成熟[14]。菌毛是細菌菌體表面類毛發(fā)樣物質(zhì)，它可以幫助菌體識別非生物表面、宿主黏膜受體及其他黏附表面[15-16]。若是使上述基因鈍化或者失活，就會出現(xiàn)菌毛缺失、細菌生物被膜生成受限、菌體黏附受到抑制[17]。因此，CsuA/B/C/D基因的顯著表達啟動了菌體生物被膜形成的初始黏附，使得菌體可以不可逆地黏附于生物表面或醫(yī)療器械的表面，這是生物被膜生成的決定性因素，也是鮑曼不動桿菌長期存活、廣泛傳播的決定性因素。CsuA/B/C/D基因是菌毛生成增加的開啟操縱子。

細菌生物被膜的生成依賴于菌毛的生物合成，需要CsuA/B/C/D基因介導(dǎo)，CsuA/B/C/D基因還介導(dǎo)菌體分泌表面活性物質(zhì)和細胞外基質(zhì)，這些是生物被膜形成早期階段所必需的[18]。此外，Csu基因簇還與鮑曼不動桿菌致病力和毒力相關(guān)[19]。相比于浮游狀態(tài)的細菌，生物被膜固著狀態(tài)的菌株更加耐藥，具有更強的致病力[15]。由于生物被膜的生成，被膜內(nèi)菌落間、菌落內(nèi)細菌間聯(lián)系和信號交換更加頻繁，細胞外DNA及基質(zhì)間物質(zhì)交換，使得生物被膜內(nèi)的菌落更容易發(fā)生質(zhì)粒或耐藥基因的轉(zhuǎn)移，生物被膜內(nèi)的菌體耐藥性更強[20-21]。因此，生物被膜使得鮑曼不動桿菌更加耐藥，具有更強的致病力，能夠生成更長時間，導(dǎo)致院內(nèi)感染反復(fù)發(fā)生[22-24]。進一步地深入研究Csu基因簇在生物被膜形成和形態(tài)維持中的作用和機制，可以為今后治療多耐藥鮑曼不動桿菌定植提供新的方向。

[1] Santajit S,Indrawattana N. Mechanisms of antimicrobial resistance in ESKAPE pathogens[J]. Biomed Res Int，2016，2016:2475067.

[2] Peleg AY,Seifert H,Paterson DL. Acinetobacter baumannii:emergence of a successful pathogen[J]. Clin Microbiol Rev,2008,21(3):538-582.

[3] Antunes LC,Visca P,Towner KJ. Acinetobacter baumannii evolution of a global pathogen[J]. Pathog Dis,2014,71(3):292-301.

[4] Rodríguez-Bao J,Martí S,Soto S,et al. Biofilm formation in acinetobacter baumannii:associated features and clinical implications[J]. Clin Microbiol Infect,2008,14(3):276-278.

[5] Pletzer D,Mansour SC,Wuerth K,et al. New mouse model for chronic infections by gram-negative bacteria enabling the study of anti-infective efficacy and host microbe interactions[J]. Mbio,2017,28(1):14-17.

[6] Lee HW,Koh YM,Kim J,et al. Capacity of multidrug resistant clinical isolates of acinetobacter baumannii to form biofilm and adhere to epithelial cell surfaces[J].2008,14(1):49-54.

[7] Lin MF,Lan CY. Antimicrobial resistance in Acinetobacter baumannii:From bench to bedside[J]. World J Clin Cases,2014,2(12):787-814.

[8] Wang Y,Wilks JC,Danhorn T,et al. Phenazine-1-carboxylic acid promotes bacterial biofilm development via ferrous iron acquisition[J]. J Bacterial,2011,193(14):3606-3617.

[9] Gaddy JA,Actis LA. Regulation of Acinetobacter baumannii biofilm formation[J]. Future Microbiol,2009,4(3):273-278.

[10] Domenech de Cellès M,Salomon J,Marinier A,et al. Identifying more epidemic clones during a hospital outbreak of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii[J]. PLoS One,2012,7(9):e45758.

[11] Espinal P,Martí S,Vila J. Effect of biofilm formation on the survival of acinetobacter baumannii on dry surfaces[J]. J Hosp Infect,2012,80(1):56-60.

[12] 劉原，柯蕊，楊妮,等.呼吸道分離鮑曼不動桿菌生物被膜形成能力與耐藥性關(guān)系的研究[J].中國實驗診斷學(xué),2015,19(8):1243-1246.

[13] Tomaras AP,Dorsey CW,Edelmann RE,et al. Attachment to and biofilm formation on abiotic surfaces by acinetobacter baumannii:involvement of a novel chaperone usher pili assembly system[J]. Microbiology,2003,149(Pt 12):3473-3484.

[14] Tomaras AP,Flagler MJ,Dorsey CW. Characterization of a two component regulatorty system from Acinetobacter baumannii that controls biofilm formation and cellular morphology[J]. Microbiology,2008,154(Pt 11):3398-3409.

[15] Pakharukova N,Tuittila M,Paavilainen S,et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of the Csu pili CsuC-CsuA/B chaperone major subunit pre-assembly complex from Acinetobacter baumannii[J]. Acta Crytalloqr F Struct Boil Commun,2015,71(Pt 6):770-774.

[16] Perez LR. Acinetobacter baumannii displays inverse relationship between meropenem resistance and biofilm production[J]. J Chemother,2015，27(1):13-16.

[17] Liou ML,Soo PC,Ling SR,et al. The sensor kinase BfmS mediates virulence in Acinetobacter baumannii[J]. J Microbiol Immunol Infect,2014,47(4):275-281.

[18] Kostoulias X,Murray GL,Cerqueira GM,et al. Impact of a cross kingdom signaling molecule of candida albicans on Acinetobacter baumannii physiology[J]. Antimicrob Agents Chemother,2015,60(1):161-167.

[19] Cornejo-Jurez P,Vilar-Compte D,Pérez-Jimenez C,et al. The impact of hospital acquired infections with multidrug resistant bacteria in an oncology intensive care unit[J]. Int J Infect Dis,2015,31:31-34.

[20] Selasi GN,Nicholas A,Jeon H,et al. Differences in bifilm mass,expression of biofilm associated genes,and resistance to desiccation between epidemic and sporadic clones of carbapenem resistant acinetobacter baumannii sequence type 191[J]. PLoS One,2016,11(9):e0162576.

[21] Martins N,Pic?o RC,Adams-Sapper S,et al. Association of class 1 and 2 integrons with multidrug resistant Acinetobacter baumannii international clones and Acinetobacter nosocomialis isolates[J]. Antimicrob Agents Chemother,2015,59(1):698-701.

[22] Luo TL,Rickard AH,Srinivasan U,et al. Association of blaOXA-23 and bap with the persistence of Acinetobacter baumannii within a major healthcare system[J]. Front Microbiol，2015，6:182.

[23] De Gregorio E,Roscetto E,Iula VD,et al. Development of a real-time PCR assay for the rapid detection of Acinetobacter baumannii from whole blood samples[J]. New Microbiol,2015,38(2):251-257.

[24] 孫靜娜，劉青松，劉澤世,等.多重耐藥及泛耐藥鮑曼不動桿菌外排泵基因adeB的研究[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2014,35(10)：1166-1169.

(本文編輯：許卓文)

Genomics studies the role of the Csu cluster in the biofilm formation

LI Hai-tao, ZHANG Lu-tao, LI Shuai, WANG Bo-li, QI Tian-jie, LI Hong-lin

(TheFirstDepartmentofRespiratoryMedicine,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China)

Objective To study the role of Csu cluster in the biofilm formation of the multidrug resistant Acinetobacter baumannii by genomics. Methods The bacteria were selected from the clinical laboratory of our hospital. The rapidly growth period and biofilm stage were obtained. The mRNA of the two different stages were extracted and sequenced. Compared the gene sequence with the public database, we found the differences in gene expression. Results There were significant differences in the expression of genes between the two strains in the rapid growth phase and biofilm stage of the same strain. In the biofilm state, the expression of 106 genes was up-regulated in the cells with rapid growth phase, in which the expression of CsuA/B/C/D gene cluster was significantly increased, and the expression of 92 genes was down regulated. Conclusion The Csu cluster played an important role in biofilm formation and maintenance. In the formation of biofilm, the initial adhesion of the cells required significant expression of the Csu A/B/C/D. The Csu cluster mediated the biosynthesis of pili and the secretion of extracellular matrix, which were necessary for the early stages of the biofilm formation.

Acinetobacter baumannii; drug resistance, multiple; genetic testing

2017-04-07；

2017-05-05

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題(ZL20140206，20130503)

李海濤(1983-)，男，河北南宮人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事呼吸疾病診治研究。

R378.79

A

1007-3205(2017)08-0869-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.08.001